本发明专利技术公开了一种区别牛病毒性腹泻病毒1型和牛病毒性腹泻病毒2型的RT-PCR-RFLP方法，该方法是利用牛病毒性腹泻病毒1型和牛病毒性腹泻病毒2型的5’端的保守区基因序列酶切位点差异来进行区别的，包括RNA的提取，RT-PCR扩增得，PstⅠ酶切后进行RFLP分析。本发明专利技术鉴定方法简单，操作简便，可有效用于牛病毒性腹泻病毒1型和牛病毒性腹泻病毒2型简便诊断。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于动物传染病学
，涉及一种区别牛病毒性腹泻病毒1型和2型RT-PCR-RFLP方法，具体涉及一种利用牛病毒性腹泻病毒1型和牛病毒性腹泻病毒2型的5’端基因序列酶切位点差异来区分牛病毒性腹泻病毒1型和牛病毒性腹泻病毒2型的逆转录（RT，reversetranscription）-聚合酶链式反应(PCR，polymerasechainreaction)—限制性片段长度多态性（RFLP，restrictionfragmentlengthpolymorphism）方法。
技术介绍
牛病毒性腹泻病毒（Bovineviraldiarrheavirus，BVDV）属于黄病毒科瘟病毒属成员，可引起牛病毒性腹泻/粘膜病。该病除可感染牛（尤其是犊牛）外，还见有感染猪、羊和鹿等动物。当前，牛病毒性腹泻病毒分为2个基因型：基因1型和基因2型。基因1型牛病毒性腹泻病毒感染的主要症状为一过性发热、腹泻和急慢性粘膜病。基因2型引起的症状主要表现为发烧、腹泻、呼吸失调和血小板减少等，主要导致奶牛流产，对牛的致死性较高。当前，基因1型和基因2型牛病毒性腹泻病毒在我国均见有报道，急需一种快速鉴别诊断方法来区分牛群中的基因1型和基因2型牛病毒性腹泻病毒感染。目前，BVDV的病原诊断主要有病毒分离、血清中和、ELISA及PCR方法等。当前，检测基因1型和基因2型牛病毒性腹泻病毒的PCR已见有研究报道，但使用的引物一般在两组（4条）及以上，分别针对基因1型和基因2型牛病毒性腹泻病毒的基因组特征来设计。本专利技术通过分析比较基因1型和基因2型牛病毒性腹泻病毒的基因组特征，建立一种可用于基因1型和基因2型牛病毒性腹泻病毒的鉴别诊断方法。该方法仅需一组特异性引物对基因1型和基因2型牛病毒性腹泻病毒的核酸RNA进行RT-PCR扩增，通过基因1型和基因2型牛病毒性腹泻病毒RT-PCR扩增产物中酶切位点的差异进行酶切鉴定，建立区分基因1型和基因2型牛病毒性腹泻病毒的RT-PCR-RFLP鉴别诊断方法。目前，国内外尚无有关利用RT-PCR-RFLP方法来区分基因1型和基因2型牛病毒性腹泻病毒的报道，本专利技术填补该领域的空白。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种区别牛病毒性腹泻病毒1型和2型RT-PCR-RFLP方法，根据基因1型和基因2型牛病毒性腹泻病毒全基因序列5’末端序列的特征，设计一组（2条）引物可同时对基因1型和基因2型牛病毒性腹泻病毒进行RT-PCR扩增。在基因1型和基因2型牛病毒性腹泻病毒RT-PCR扩增中，基因1型牛病毒性腹泻病毒中含有PstⅠ酶（酶切位点序列为CTGCAG），而基因2型牛病毒性腹泻病毒中没有该酶切位点，通过对RT-PCR产物的PstⅠ酶切来建立基因1型和基因2型牛病毒性腹泻病毒快速鉴别诊断的RT-PCR-RFLP方法。本专利技术采用以下技术方案：一种区别基因1型和基因2型牛病毒性腹泻病毒的RT-PCR-RFLP方法，包括以下步骤：（1）提取基因1型和基因2型牛病毒性腹泻病毒基因核酸RNA；（2）用引物BVDV-12F和BVDV-12R同时对基因1型和基因2型牛病毒性腹泻病毒进行RT-PCR扩增，得到相应的RT-PCR扩增片段；（3）取RT-PCR扩增片段产物进行经PstⅠ酶切分析。其中，RT-PCR扩增引物（BVDV-12F和BVDV-12R）需满足如下要求：①该组RT-PCR扩增引物区需根据基因1型和基因2型牛病毒性腹泻病毒基因组保守区设计，可同时对基因1型和基因2型牛病毒性腹泻病毒进行阳性RT-PCR扩增，目的片段大小为335bp。②该组RT-PCR扩增引物（BVDV-12F和BVDV-12R）扩增基因1型和基因2型牛病毒性腹泻病毒的片段中，仅基因1型牛病毒性腹泻病毒扩增产物中含有PstⅠ酶切位点，可被切成2段（236bp和99bp），而基因2型牛病毒性腹泻病毒扩增产物中没有PstⅠ酶切位点，被PstⅠ酶切后大小不变，仍为335bp。根据以上要求，所述的步骤（2）的扩增引物BVDV-12F和BVDV-12R的序列为：上游引物BVDV-12F：5’-GCTAGCCATGCCCTTAGTA-3’，下游引物BVDV-12R：5’-GGTTTTTGTTTRTATGTTTTGTAT-3’；其中，所述的步骤（2）的RT-PCR扩增产物大小为335bp。所述的步骤（3）的RT-PCR扩增产物，牛病毒性腹泻病毒1型RT-PCR扩增产物的236-241处序列为CTGCAG，可被PstⅠ酶切成236bp和99bp大小的两段；牛病毒性腹泻病毒1型RT-PCR扩增产物的236-241处序列为TAGCAG，被PstⅠ酶切后大小不变，还是335bp。所述的引物在制备区别牛病毒性腹泻病毒1型和2型检测试剂盒中的应用。本专利技术的有益效果：鉴定方法准确有效。使用本方法对临床收集的牛病料50份进行RT-PCR-RFLP检测，其中基因1型牛病毒性腹泻病毒阳性6份、基因2型牛病毒性腹泻病毒2份，没有检测到基因1型和基因2型牛病毒性腹泻病毒共感染（co-infection）情况。附图说明图1为基因1型和基因2型牛病毒性腹泻病毒RT-PCR-RFLP方法的电泳图；M为DL500DNAMarker；1为基因2型牛病毒性腹泻病毒RT-PCR胶回收产物；2为基因1型牛病毒性腹泻病毒RT-PCR胶回收产物；3为经PstⅠ酶切的基因2型牛病毒性腹泻病毒RT-PCR胶回收产物；4为经PstⅠ酶切的基因1型牛病毒性腹泻病毒RT-PCR胶回收产物；5为实验阴性对照。图21型BVDV和2型BVDV基因组比较。具体实施方式下面实施例对本专利技术做进一步的描述。实施例11、引物设计根据GenBank中登陆的基因1型牛病毒性腹泻病毒（GenBank登录号AB078951、AF041040、AJ133738、EU183197、KP941584和M96751）和基因2型牛病毒性腹泻病毒（GenBank登录号U18059、KT823819、KF835701、AY149216、AF502399和AF002227）的基因序列进行分析比较，发现基因1型牛病毒性腹泻病毒中含有PstⅠ酶（酶切位点序列为CTGCAG），而基因2型牛病毒性腹泻病毒中没有该酶切位点（该处序列为TAGCAG）（图2）。实验所需的引物根据基因1型牛病毒性腹泻病毒（GenBank登录号M96751）和基因2型牛病毒性腹泻病毒（GenBank登录号U18059）设计，引物序列为上游引物BVDV-12F：5’-GCTAGCCATGC本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于区别牛病毒性腹泻病毒1型和2型的RT‑PCR‑RFLP方法的引物，其特征在于：所述引物序列为：上游引物BVDV‑12F：5’‑ GCTAGCCATGCCCTTAGTA ‑3’，下游引物BVDV‑12R：5’‑ GGTTTTTGTTTRTATGTTTTGTAT ‑3’。
【技术特征摘要】
1.一种用于区别牛病毒性腹泻病毒1型和2型的RT-PCR-RFLP方法的引物，其特征在于：
所述引物序列为：
上游引物BVDV-12F：5’-GCTAGCCATGCCCTTAGTA-3’，
下游引物BVDV-12R：5’-GGTTTTTGTTTRTATGTTTTGTAT-3’。
2.一种区别牛病毒性腹泻病毒1型和2型的RT-PCR-RFLP方法，其特征在于：包括如下步
骤：
（1）提取牛病毒性腹泻病毒1型和牛病毒性腹泻病毒2型的核酸RNA；
（2）用针对牛病毒性腹泻病毒1型和牛病毒性腹泻病毒2型的...
【专利技术属性】
技术研发人员：张德明，林燕花，张梦青，陈莉莉，
申请(专利权)人：福清市默克兽医院，
类型：发明
国别省市：福建;35
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