一种超敏感超顺磁性纳米免疫微球及其检测GP73抗原的方法技术

本发明专利技术涉及诊断试剂技术领域，特别涉及一种磁性免疫体外诊断试剂。为了解决传统酶联免疫方法中固定的抗体容量较小、反应时间较长、灵敏度相对较低和固定的抗体稳定性较低的技术问题，本发明专利技术提供一种GP73单克隆抗体及一种表面偶联有GP73单克隆抗体的超顺磁性纳米免疫微球，及利用该微球采用双抗体夹心酶免法或化学发光法检测人血清或血浆中GP73抗原的方法。用于产生所述GP73单克隆抗体的抗原具有下述氨基酸序列：AAAERGAVELKK。本发明专利技术提供的超顺磁性纳米免疫微球具有偶联更多抗体、免疫反应速度较快、特异性高、重复性好、成本低、实验条件要求简单等特点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于诊断试剂
，涉及磁性免疫体外诊断试剂，特别涉及一种表面偶联有GP73单克隆抗体的超顺磁性纳米免疫微球，及利用该微球采用双抗体夹心酶免法或化学发光法检测人血清或血浆中GP73抗原的方法。
技术介绍
肝癌是常见的恶性肿瘤之一,“早诊、早治”是防治肝癌的关键。目前临床上对肝癌的诊断方法主要是影像学和血清标志物甲胎蛋白(AFP)的检测，早期肝癌直径小，影像学几乎检测不到，AFP诊断敏感性较低(25％)，会漏检一部分早期肝癌患者。高尔基体蛋白73(GP73)被认为是目前最好的肝癌早期诊断血清学标志物之一，其检测敏感性和特异性均高于AFP。国内外已有的GP73试剂均为传统的酶联免疫方法，该方法的不足之处在于检测灵敏度较低，反应时间较长。磁性纳米微球具有超顺磁性，具有巨大的比表面积和可以偶联多种生物分子的特点。在无外加磁场时磁性纳米微球均匀分散在溶液中，使抗原-抗体快速、高效反应，在外加磁场的作用下，超顺磁性纳米微球可快速移动，通过吸附、洗涤、解吸附等操作步骤从复杂的生物化学混合物体系中分离得到目标分子；传统的酶联免疫方法是通过物理吸附将生物分子固定在酶标板表面，因而限制了该方法的敏感性和稳定性。磁性纳米微球有巨大的比表面积，可偶联更大量的生物分子，并且通过双功能化学试剂将生物分子共价偶联在其表面，因而大大提高反应速度、检测灵敏度和稳定性。
技术实现思路
为了解决现有技术中肝癌诊断试剂检测用时长、抗体固定容量小、灵敏度较低和稳定性较差的技术问题，为了解决传统酶联免疫方法中固定的抗体容量较小、反应时间较长、灵敏度相对较低和固定的抗体稳定性较低的技术问题，本专利技术提供一种GP73单克隆抗体及一种表面偶联有GP73单克隆抗体的超顺磁性纳米免疫微球，及利用该微球采用双抗体夹心酶免法或化学发光法检测人血清或血浆中GP73抗原的方法。用于产生所述GP73单克隆抗体的抗原具有下述氨基酸序列：AAAERGAVELKK。本专利技术提供的超顺磁性纳米免疫微球具有偶联更多抗体、免疫反应速度较快、特异性高、重复性好、成本低、实验条件要求简单等特点。本专利技术提供的超顺磁性纳米免疫微球，及利用该微球检测GP73抗原的方法，能够用于肝癌早期诊断。为达到上述目的，本专利技术的技术解决方案是：本专利技术提供一种用于检测GP73抗原的单克隆抗体，用于产生所述单克隆抗体的抗原具有下述氨基酸序列：AAAERGAVELKK(参见序列1)。进一步的，所述单克隆抗体是CGMCC保藏编号9806的GP73单克隆抗体杂交瘤细胞产生的抗体。用于检测GP73抗原的抗体称为GP73抗体。所述GP73单克隆抗体具有高免疫活性。GP73抗体针对GP73抗原的超保守部位(PCSite)，因此具有高度敏感性和特异性。本专利技术还提供一种超顺磁纳米免疫微球，所述纳米免疫微球包括纳米微球，所述纳米微球上偶联有所述GP73单克隆抗体。所述超顺磁纳米免疫微球可简称为磁性免疫微球。所述GP73单克隆抗体通过双功能化学试剂共价偶联在磁性纳米微球表面。所述双功能化学试剂是戊二醛，或，EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)碳二亚胺。进一步的，所述超顺磁纳米免疫微球中，所述纳米微球包括微球核心和无机小分子，所述无机小分子覆盖在微球核心的表面形成无机小分子层，所述纳米微球通过无机小分子偶联所述抗体。所述微球核心表面覆盖薄层无机小分子，可减少非特异性吸附。所述微球表面利用-NH2，-COOH，或PEI(聚醚酰亚胺)进行表面化学修饰。所述微球核心的材质是四氧化三铁，所述微球核心的直径尺寸为6-12nm；所述微球的直径为10～30nm。进一步的，所述微球核心的直径尺寸为8nm。所述的超顺磁纳米免疫微球中，所述无机小分子是二氧化硅(SiO2)。本专利技术还提供一种用于检测GP73的多克隆抗体，用于产生所述多克隆抗体的抗原选自下述氨基酸序列的片段：QMKEVKEQCEERIEEVTKKGNEAVASRDLSENNDQRQQLQALSEPQPRLQAAGLPHTEVPQGKGNVLGNSKSQTPAPSSEVVLDSKRQVEKEETNEIQVVNEEPQRDRLPQEPGREQVVEDRPVGGRGFGGAGELGQTPQVQAALSVSQENPEMEGPERDQLVIPDGQEEEQEAAGEGRNQQKLRGEDDYNMDENEAESETDKQAALAGNDRNIDVFNVEDQKRDTINLLDQREKRNHTL(参见序列5)。用于检测GP73抗原的多克隆抗体称为GP73多克隆抗体。所述GP73多克隆抗体上偶联酶标记物。进一步的，用于产生所述多克隆抗体的抗原为下述氨基酸序列中至少两种氨基酸序列的组合：MKEVKEQCE(参见序列2)；EAVASRDLS(参见序列3)；PERDQLVIP(参见序列4)。本专利技术还提供一种制备上述纳米免疫微球的方法，所述方法包括下述步骤：(1)取50-200μl超顺磁性纳米微球；(2)对微球表面进行化学修饰；(3)将双功能化学试剂共价偶联在磁性纳米微球表面；(4)用洗涤液进行洗涤；a.将超顺磁性纳米微球加入400-800μl洗涤液，并使之分散；b.磁性分离，弃上清液；(5)加入浓度为0.5～3mg/ml的GP73单克隆抗体溶液，恒温振荡反应；(6)磁性分离，弃上清液；(7)用相同洗涤液进行洗涤；a.每次加入洗涤液400-800μl，并使之分散；b.磁性分离，弃上清液；c.重复以上洗涤步骤2-3次；d.加入0.5～2ml贮存液，4℃保存备用。所述洗涤液为0.01～0.2M的碳酸盐缓冲液，PH＝8.0～9.5；或0.01～0.2M的三羟甲基氨基甲烷-盐酸盐缓冲液，PH＝7.0～7.6。所述GP73单克隆抗体的溶液采用碳酸盐缓冲液，PH＝8.0～9.5；或0.01～0.2M的三羟甲基氨基甲烷-盐酸盐缓冲液，PH＝7.0～7.6。所述贮存液为0.01～0.2M的PB，PH＝7.0～8.0；或0.01～0.2M的Tris-HCl，PH＝7.0～8.0；所述贮存液中均加入防腐剂，所述防腐剂为0.01～0.2％的NaN3或者0.01～0.2％的硫柳汞。所述防腐剂的浓度单位为重量(克)体积比(毫升)。所述第(5)步中恒温振荡反应的温度为4～40℃，反应时间为10～60分钟，振动速度为180～200rpm。本专利技术还提供一种杂交瘤本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测GP73抗原的单克隆抗体，其特征在于，用于产生所述单克隆抗体的抗原具有下述氨基酸序列：AAAERGAVELKK。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测GP73抗原的单克隆抗体，其特征在于，用于产生所述单克隆
抗体的抗原具有下述氨基酸序列：
AAAERGAVELKK。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体是CGMCC
保藏编号9806的GP73单克隆抗体杂交瘤细胞产生的抗体。
3.一种超顺磁纳米免疫微球，其特征在于，所述纳米免疫微球包括纳米微球，
所述纳米微球上偶联有权利要求1或2所述的GP73单克隆抗体。
4.根据权利要求3所述的超顺磁纳米免疫微球，其特征在于，所述纳米微球包
括微球核心和无机小分子，所述无机小分子覆盖在微球核心的表面形成无机小
分子层，所述纳米微球通过无机小分子偶联所述抗体。
5.根据权利要求4所述的超顺磁纳米免疫微球，其特征在于，所述无机小分子
是二氧化硅(SiO2)。
6.一种用于检测GP73的多克隆抗体，其特征在于，用于产生所述多克隆抗体
的抗原选自下述氨基酸序列的片段：
QMKEVKEQCEERIEEVTKKGNEAVASRDLSENNDQRQQLQALSEP
QPRLQAAGLPHTEVPQGKGNVLGNSKSQTPAPSSEVVLDSKRQVE
KEETNEIQVVNEEPQRDRLPQEPGREQVVEDRPVGGRGFGGAGEL
GQTPQVQAALSVSQENPEMEGPERDQLVIPDGQEEEQEAAGEGRN
QQKLRGEDDYNMDE...

【专利技术属性】
技术研发人员：石英，陈德喜，李宁，谢立，刘凯，黄雁翔，刘芳，
申请(专利权)人：北京市肝病研究所，首都医科大学附属北京佑安医院，
类型：发明
国别省市：北京;11