一种农杆菌介导侵染转化蒙古柳的方法，本发明专利技术涉及植物基因工程领域，特别是涉及一种细菌介导侵染转化蒙古柳的方法。本发明专利技术的目的是为了解决现有技术中没有蒙古柳的遗传转化受体再生体系的建立方法，而提供了一种农杆菌介导侵染转化蒙古柳的方法。本发明专利技术利用农杆菌介导侵染转化外植体为叶片诱导的愈伤组织，共培养和筛选转化愈伤组织，并诱导分化抗性丛生芽，在生根培养培养基上再生成植株，GUS染色检测转化再生植株表明有35S启动下β-半乳糖苷酶活性。证明通过本发明专利技术的方法实现了农杆菌介导侵染转化蒙古柳。本发明专利技术的农杆菌介导侵染转化蒙古柳的方法用于植物基因工程领域。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及植物基因工程领域，特别是涉及一种细菌介导侵染转化蒙古柳的方法。
技术介绍
蒙古柳(Salixmongolica)，杨柳科(Salicaceae)，柳属(Salix)，属种名定名：Salixmongolicaf.sericeaChang.etSkv。松嫩苏打盐碱草甸草原上的乡土灌木树种，小枝细长，叶线形或线状披针形，长5-15厘米，宽5-9毫米，幼叶有绒毛，后无毛，表面绿色，背面苍白色，边缘有腺锯齿；叶柄长8-12毫米。花先叶开放，接近同时开放，无花序梗，基部常有3个小叶；雄花序长2-3厘米，粗2-3毫米；雄蕊2个完全合生，雌花序长2.5-3.0厘米，粗约4毫米；子房有毛，无柄，花柱无或极短，柱头头状；苞片同雄花。分布：黑龙江、吉林、辽宁、河北等省；蒙古，苏联也有。蒙古柳的粗蛋白的含量>15％，叶中赖氨酸含量在2％左右，接近草木犀和苜蓿的水平，这一特点表明可以作为木本饲料，也是青黄不接的冬春两季草本饲料缺陷时的重要补充。植物遗传转化的基础是相应外植体的离体再生，只有高频的外植体离体再生系统，才能建立高效率的遗传转化体系。自从1985年Horsh等人首创了农杆菌叶盘转化法，大大推动了农杆菌介导转化方法的应用，并促使植物遗传转化的研究得到了迅速发展，而且已成为现在广为应用的首选方法之一。目前国内外已有关于树木组织培养及离体再生方面相关报道，自从Parson等于1986年证实杨树可以进行遗传转化和外源基因在林木细胞中表达以来，林木基因工程研究已经取得很大进展。现已对杨树、火炬松、花旗松、白云杉、桤木、刺槐、麻栎、桉树、欧洲赤松、兰伯氏松、挪威云杉等20多个树种进行了转化研究。还有金丝垂柳J1010和旱柳建立了农杆菌侵染介导的遗传转化体系，并通过GUS组织化学染色转基因愈伤组织进行了初步检测。但是，仍未见蒙古柳的遗传转化受体再生体系建立的报道。基因工程的发展和应用为林木育种开辟了一条新的途径。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决现有技术中没有蒙古柳的遗传转化受体再生体系的建立方法，而提供了一种农杆菌介导侵染转化蒙古柳的方法。本专利技术利用农杆菌介导侵染转化外植体为叶片诱导愈伤组织，共培养和筛选转化愈伤组织，并诱导分化抗性丛生芽，在生根培养培养基上再生成植株，GUS染色检测转化再生植株表明有35S启动下β-半乳糖苷酶活性。本专利技术的农杆菌介导侵染转化蒙古柳的方法按如下步骤进行：一、人工培育蒙古柳无菌苗的叶片愈伤组织的诱导：蒙古柳种子用体积分数为69％～71％的酒精和体积分数为2％～4％的次氯酸钠消毒、灭菌后，在1/2MS培养基上发芽后，生长到4叶期或5叶期的无菌苗，剪取无菌苗长×宽为(0.5cm±0.1cm)×(0.5cm±0.1cm)的叶片在MSYD1培养基上诱导愈伤组织；27.5℃～28.5℃条件下，先光照条件下培养14h，再暗条件下培养10h，这样光暗条件交替培养20～25天，然后更换一次培养基，60～65天诱导出愈伤组织；二、农杆菌侵染转化和共培养：挑取含PBI121质粒的农杆菌，单克隆培养于含有50mg/L±2mg/L卡那霉素和100mg/L±2mg/L利福平的YEP液体培养基中；在27.5℃～28.5℃条件下，以200rpm/min培养，至农杆菌菌株浓度为在7101紫外分光光度计λ＝600下，测得参数OD值为0.5～0.8时，在YEP液体培养基中加入50μL±1μL浓度为100mM/L±5mM/L的乙酰丁香酮继续培养1～2小时；将培养基转入无菌的离心管中，常温下，4500rpm/分钟，离心15min～20min收集农杆菌；以液体MS培养基重新悬浮农杆菌，调节农杆菌菌株浓度为在7101紫外分光光度计λ＝600下，测得参数OD值为0.5～0.8时；无菌操作台中，用镊子将步骤一诱导出的愈伤组织夹成直径为3mm～5mm的块状，加入悬浮好的农杆菌菌液10～20ml，同时加入20μL±1μL浓度为100mM/L的乙酰丁香酮，在侵染5min～15min后，常温下，以50rpm/min培养5min～10min；弃去全部农杆菌菌液，用无菌滤纸吸去愈伤组织表面残留的菌液，然后将愈伤组织转入铺有用MS培养液体充分浸透过的无菌滤纸的愈伤组织筛选培养基MSYD1上，在24℃～26℃条件，全天黑暗培养2-3天，得到共培养的愈伤组织；三、脱菌与抗性丛生芽的分化：将步骤二共培养的愈伤组织放到无菌蒸馏水中洗去表面的菌，然后加入浓度为1000mg/L±10mg/L的羧苄青霉素的溶液中振荡洗菌20min～30min，再用无菌蒸馏水洗2～3次，放在灭菌滤纸上吸干，接种到筛选愈伤诱导培养基MSYD2，在24℃～26℃下，先光照条件下培养10h，再暗条件下培养14h，这样光暗条件交替培养21天～22天；将抗性愈伤组织转接到筛选分化培养基MSFH3上，在7101紫外分光光度计λ＝600下，测得的OD值为0.5～0.8时，在24℃～26℃条件，先光照条件下培养10h，再暗条件下培养14h，这样光暗条件交替培养20～25天，继代培养1次～2次，直到分化出抗性丛生芽；四、抗性丛生芽生根培养获得抗性转化子：取在浓度为50mg/L±2mg/L的卡那霉素上抗性生长的单个芽接种到生根培养基上MSSG4，在24℃～26℃条件，先光照条件下培养10h，再暗条件下培养14h，这样光暗条件交替培养20天～22天长出主根；进一步接种到状苗培养基MSSG5，在22℃～24℃条件下，先光照条件下培养8h，再暗条件下培养16h，这样光暗条件交替培养20～25天，得到转化植株；通风炼苗后，移栽至温室花盆中培养成一年生苗，即获得了抗性转化子。本专利技术的含PBI121质粒的农杆菌是将PBI121质粒通过常规方法转入农杆菌中获得的。本专利技术相对于现有技术的优点：本专利技术建立的蒙古柳的遗传转化方法，转化效率达到10％左右，为采用转基因方法对耐苏打盐碱植物蒙古柳的遗传改良和获得新品系奠定了基础。附图说明图1为由蒙古柳愈伤组织诱导出的叶片；图2为由蒙古柳叶片诱导出的愈伤组织；图3为筛选分化到的抗性胚芽；图4为筛选分化到的抗性丛生芽；图5为由蒙古柳叶片愈伤组织分化成再生植株图6为由蒙古柳叶片愈伤组织分化成再生植株盆苗图7为工作菌液侵染时间对Kana抗性转化子的分化率的影响图8为转gus基因抗性T1代植株的PCR检测电泳结果，其中，1为DNAMarkerDL2000、2为阳性对照株系、3为阴性对照株系、4～11为抗性T1代植株；图9为转gus基因抗性本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种农杆菌介导侵染转化蒙古柳的方法，其特征在于：该转化方法按以下步骤进行：一、人工培育蒙古柳无菌苗的叶片愈伤组织的诱导：蒙古柳种子用体积分数为69％～71％的酒精和体积分数为2％～4％的次氯酸钠消毒、灭菌后，在1/2MS培养基上发芽后，生长到4叶期或5叶期的无菌苗，剪取无菌苗长×宽为(0.5cm±0.1cm)×(0.5cm±0.1cm)的叶片在MSYD1培养基上诱导愈伤组织；于27.5℃～28.5℃，先光照条件下培养14h，再暗条件下培养10h，这样光暗条件交替培养20～25天，然后更换一次培养基，60～65天诱导出愈伤组织；二、农杆菌侵染转化和共培养：挑取含PBI121质粒的农杆菌，单克隆培养于含有50mg/L±2mg/L卡那霉素和100mg/L±2mg/L利福平的YEP液体培养基中；在27.5℃～28.5℃条件下，以200rpm/min培养，至农杆菌菌株浓度OD600值为0.5～0.8时，继续向培养液中加入50μL±1μL浓度为100mM/L±5mM/L的乙酰丁香酮培养1～2小时；将培养液转入无菌的离心管中，常温下，4500rpm/分钟，离心15min～20min收集农杆菌；以液体MS培养基重新悬浮农杆菌，调节农杆菌菌株浓度OD600值为0.5～0.8时；无菌操作台中，用镊子将步骤一诱导出的愈伤组织夹成直径为3mm～5mm的块状，加入悬浮好的农杆菌菌液10～20mL，同时加入20μL±1μL浓度为100mM/L的乙酰丁香酮，在侵染5min～15min后，常温下，以50rpm/min摇床培养5min～10min；弃去全部农杆菌菌液，用无菌滤纸吸去愈伤组织表面残留的菌液，然后将愈伤组织转入铺有用MS培养基充分浸透过的无菌滤纸的愈伤组织筛选培养基MSYD1上，在24℃～26℃条件，全天黑暗培养2‑3天，得到共培养的愈伤组织；三、脱菌与抗性丛生芽的分化：将步骤二共培养的愈伤组织放到无菌蒸馏水中洗去表面的菌，然后加入浓度为1000mg/L±10mg/L的羧苄青霉素的溶液中振荡洗菌20min～30min，再用无菌蒸馏水洗2～3次，放在灭菌滤纸上吸干，接种到筛选愈伤诱导培养基MSYD2，在24℃～26℃下，先光照条件下培养10h，再暗条件下培养14h，这样光暗条件交替培养21天～22天；将抗性愈伤组织转接到筛选分化培养基MSFH3上，至OD600值为0.5～0.8时，，在24℃～26℃条件，先光照条件下培养10h，再暗条件下培养14h，这样光暗条件交替培养20～25天，继代培养1次～3次，直到分化出抗性丛生芽；四、抗性丛生芽生根培养获得抗性转化子：取步骤三分化出抗性丛生芽中的单个芽接种到生根培养基上MSSG4，在24℃～26℃条件，先光照条件下培养10h，再暗条件下培养14h，这样光暗条件交替培养20天～22天长出主根；进一步接种到状苗培养基MSSG5，在22℃～24℃条件下，先光照条件下培养8h，再暗条件下培养16h，这样光暗条件交替培养20～25天，得到转化植株；通风炼苗后，移栽至温室花盆中培养成一年生苗，即获得了抗性转化子。...
【技术特征摘要】
1.一种农杆菌介导侵染转化蒙古柳的方法，其特征在于：该转化方法按以下步骤进行：
一、人工培育蒙古柳无菌苗的叶片愈伤组织的诱导：蒙古柳种子用体积分数为69％～
71％的酒精和体积分数为2％～4％的次氯酸钠消毒、灭菌后，在1/2MS培养基上发芽后，生
长到4叶期或5叶期的无菌苗，剪取无菌苗长×宽为(0.5cm±0.1cm)×(0.5cm±0.1cm)的叶
片在MSYD1培养基上诱导愈伤组织；于27.5℃～28.5℃，先光照条件下培养14h，再暗条件下
培养10h，这样光暗条件交替培养20～25天，然后更换一次培养基，60～65天诱导出愈伤组
织；
二、农杆菌侵染转化和共培养：挑取含PBI121质粒的农杆菌，单克隆培养于含有50mg/L
±2mg/L卡那霉素和100mg/L±2mg/L利福平的YEP液体培养基中；在27.5℃～28.5℃条件
下，以200rpm/min培养，至农杆菌菌株浓度OD600值为0.5～0.8时，继续向培养液中加入50μL
±1μL浓度为100mM/L±5mM/L的乙酰丁香酮培养1～2小时；将培养液转入无菌的离心管中，
常温下，4500rpm/分钟，离心15min～20min收集农杆菌；以液体MS培养基重新悬浮农杆菌，
调节农杆菌菌株浓度OD600值为0.5～0.8时；无菌操作台中，用镊子将步骤一诱导出的愈伤
组织夹成直径为3mm～5mm的块状，加入悬浮好的农杆菌菌液10～20mL，同时加入20μL±1μL
浓度为100mM/L的乙酰丁香酮，在侵染5min～15min后，常温下，以50rpm/min摇床培养5min
～10min；弃去全部农杆菌菌液，用无菌滤纸吸去愈伤组织表面残留的菌液，然后将愈伤组
织转入铺有用MS培养基充分浸透过的无菌滤纸的愈伤组织筛选培养基MSYD1上，在24℃～
26℃条件，全天黑暗培养2-3天，得到共培养的愈伤组织；
三、脱菌与抗性丛生芽的分化：将步骤二共培养的愈伤组织放到无菌蒸馏水中洗去表
面的菌，然后加入浓度为1000mg/L±10mg/L的羧苄青霉素的溶液中振荡洗菌20min～
30min，再用无菌蒸馏水洗2～3次，放在灭菌滤纸上吸干，接种到筛选愈伤诱导培养基
MSYD2，在24℃～26℃下，先光照条件下培养10h，再暗条件下培养14h，这样光暗条件交替培
养21天～22天；将抗性愈伤组织转接到筛选分化培养基MSFH3上，至OD600值为0.5～0.8时，，
在24℃～26℃条件，先光照条件下培养10h...
【专利技术属性】
技术研发人员：管清杰，汪振娟，马海燕，柳参奎，
申请(专利权)人：东北林业大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23
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