微量DNA中甲基化CpG岛高通量测序方法技术

本发明专利技术提供一种微量DNA中甲基化CpG岛高通量测序方法，包括步骤：1)将DNA样品进行亚硫酸盐处理；2)将步骤1)中获取的处理样品加入到含有引物A的PCR体系中进行线性扩增；3)向步骤2)中的PCR产物中加入具有单链DNA剪切活性的核酸外切酶，反应后使核酸外切酶失活；4)将步骤3)中的产物加入到含有引物B的PCR体系中进行线性扩增；5)将步骤4)中的产物加入含有相应接头引物C和接头引物D的PCR体系中进行扩增；6)将步骤5)中的PCR产物进行纯化获得具有特异长度的DNA文库，并进行测序。本发明专利技术采用多步PCR的方法直接富集微量DNA序列中甲基化CpG岛序列对待测目的片段进行高通量测序效率极高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种微量DNA中甲基化CpG岛高通量测序方法，属于基因测序领域。
技术介绍
DNA甲基化是DNA的一种重要修饰碱基，它主要指在胞嘧啶的5号碳原子上进行的甲基化共价修饰，基本存在于所有物种的DNA中。胞嘧啶的甲基化修饰存在于DNA中特殊结构CpG中并在双链中成对出现；在脊椎动物结构基因组中，大部分的CpG结构域主要集中在基因启动子区域，有约60％～90％的CpG区域中的胞嘧啶上发生甲基化作用。DNA的甲基化会导致DNA构象、稳定性、DNA与蛋白质相互作用的方式以及染色质结构发生改变，进而影响基因的表达调控，使其在细胞发育与分化、特征性表型基因的表达以及X染色体失活等方面发挥着巨大的作用。因而对于基因组中DNA甲基化位点的精准测序是全面理解追踪基因特征和功能的重要方面。传统的单位点甲基化检测或者测序方法(如限制性酶切，限制新酶切-PCR，甲基化特异性PCR、焦磷酸测序、荧光定量法等方法)受限于技术方法只能一次性检测单个或者多个位点，且方法比较繁杂；基于芯片的甲基化图谱可以绘制基因组甲基化图谱，但该方法需求量较小，且成本较高，不适用于大规模使用。近些年来随着第二代测序方法的发展，人们可以通过高通量测序的方法进一步系统详尽准确的认识基因组中甲基化的分布情况。目前基于高通量测序的甲基化测序方法有三种类型：(1)免疫沉淀的方法；(2)亚硫酸氢盐测序以及(3)甲基化CpG随机扩增与测序的方法(MCTA-Seq)。免疫沉淀的方法需要购买具有特异性识别效果的抗体，并且该种测序方法只能算得上是半定量，分辨率只能到100bp。亚硫酸氢盐测序方法的测序方法则能精确到碱基，是甲基化分析的金标准。该种方法是将DNA样品用亚硫酸盐进行处理后将未发生甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，然后根据酶切，跑胶纯化等步骤富集启动子以及CpG岛区域，进一步建立文库测序；但该方法程序复杂且耗时长耗费高，性价比较低，不具有广泛的适用性。甲基化CpG随机扩增与测序的方法是基于亚硫酸盐法的改进方法。该方法首先将收集到的DNA样品进行亚硫酸氢盐处理获得转化后的样品，然后通过特定引物将特定为发生甲基化CpG富集区域(特别是CpG岛区域)进行扩增并建立DNA文库，进而通过切胶的方法将目标区域片段进行富集，进而实现特定区域的甲基化CpG岛测序分析。该方法降级成本且可以有效覆盖80％以上的CpG岛区域，对于DNA中甲基化的分布分析具有重要的意义，但是该方法仍有三个较大的缺陷：1)获得的DNA文库始终包含有极大量的引物二聚物与杂质，外加亚硫酸盐测序方法的局限性，极大的干扰到实际有效测序效果，使之测序成本加大；2)引物能够捕获的CpG岛区域范围仍不能覆盖全部启动子区域；3)该方法建库纯化步骤仍极为依赖操作者的判断和技艺，不利于自动化工业化操作。目前尚缺少一个较为高效的商品化甲基化CpG岛高通量测序检测方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种微量DNA中甲基化CpG岛高通量测序方法，本专利技术采用了如下技术方案：一种DNA中甲基化CpG岛高通量测序方法，其特征在于，包括以下步骤：1)将获得的微量DNA样品进行亚硫酸盐处理，获取单链的经亚硫酸盐转换的DNA样品；2)将步骤1)中获取的处理样品加入到含有引物A的PCR体系中，并在PCR仪器中进行线性扩增；3)向步骤2)中的PCR产物中加入具有单链DNA剪切活性的核酸外切酶，于37℃中反应30分钟，然后升高温度使所述核酸外切酶失活；4)将步骤3)中的酶消化产物加入到含有引物B的PCR体系中并进行线性扩增；5)将步骤4)中的PCR产物体系再加入含有相应接头引物C和接头引物D的PCR体系中进行PCR扩增；6)将步骤5)中的PCR产物进行具有尺寸选择性的纯化方式获得具有特异长度的DNA文库，并根据测序仪要求的质控鉴定后进行高通量测序。进一步，本专利技术的DNA中甲基化CpG岛高通量测序方法，还可以具有这样的特征：其中，所述引物A的5’端序列可以与测序通用接头引物C(不限于illumina，ionproton，roche454，solid，BGIseq)相互退火结合；引物A在3’端有5-15个特殊的并可以与多个CpG区域(至少两个CpG)退火结合的序列。进一步，本专利技术的DNA中甲基化CpG岛高通量测序方法，还可以具有这样的特征：其中，引物B中5’端序列可以与接头引物D退火结合。进一步，本专利技术的DNA中甲基化CpG岛高通量测序方法，还可以具有这样的特征：引物B的3’端序列会包含一段相对随机的长为5-15的碱基的退火结合序列，此序列含有0-15个碱基C，0-15个碱基D与0-7个CpG。进一步，本专利技术的DNA中甲基化CpG岛高通量测序方法，还可以具有这样的特征：引物B的3’端最后一个碱基为D(A、T、G混合物)，第二、三个碱基紧接着一个CpG富集区，而在4～9个碱基则会包含一个碱基C，其他的碱基为D(A、T、G)。进一步，本专利技术的DNA中甲基化CpG岛高通量测序方法，还可以具有这样的特征：引物5’端序列和3’端序列则是由4-20个碱基D(A、T、G混合物)连接。进一步，本专利技术的DNA中甲基化CpG岛高通量测序方法，还可以具有这样的特征：引物B可以是单条引物，或者是多条引物的混合；进一步，本专利技术的DNA中甲基化CpG岛高通量测序方法，还可以具有这样的特征：其中，引物B是下述四条引物的混合物5’-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCATGDDDDDDDDGCGD-3’；其中，D为A或T或G。5’-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCATGDDDDDDDGDCGD-3’；其中，D为A或T或G。5’-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCATGDDDDDDGDDCGD-3’；其中，D为A或T或G。5’-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCATGDDDDDGDDDCGD-3’；其中，D为A或T或G。进一步，本专利技术的DNA中甲基化CpG岛高通量测序方法，还可以具有这样的特征：引物C的序列如下：5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’。进一步本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种微量DNA中甲基化CpG岛高通量测序方法，其特征在于，包括以下步骤：1)将获得的微量DNA样品进行亚硫酸盐处理，获取单链的经亚硫酸盐转换的DNA样品；2)将步骤1)中获取的处理样品加入到含有引物A的PCR体系中，并在PCR仪器中进行线性扩增；3)向步骤2)中的PCR产物中加入具有单链DNA剪切活性的核酸外切酶，于37℃中反应30分钟，然后升高温度使所述核酸外切酶失活；4)将步骤3)中的酶消化产物加入到含有引物B的PCR体系中并进行线性扩增；5)将步骤4)中的PCR产物体系再加入含有相应接头引物C和接头引物D的PCR体系中进行PCR扩增；6)将步骤5)中的PCR产物进行具有尺寸选择性的纯化方式获得具有特异长度的DNA文库，并根据测序仪要求的质控鉴定后进行高通量测序。

【技术特征摘要】
1.一种微量DNA中甲基化CpG岛高通量测序方法，其特征在于，包
括以下步骤：
1)将获得的微量DNA样品进行亚硫酸盐处理，获取单链的经亚
硫酸盐转换的DNA样品；
2)将步骤1)中获取的处理样品加入到含有引物A的PCR体系
中，并在PCR仪器中进行线性扩增；
3)向步骤2)中的PCR产物中加入具有单链DNA剪切活性的核
酸外切酶，于37℃中反应30分钟，然后升高温度使所述核酸外切酶
失活；
4)将步骤3)中的酶消化产物加入到含有引物B的PCR体系中
并进行线性扩增；
5)将步骤4)中的PCR产物体系再加入含有相应接头引物C和
接头引物D的PCR体系中进行PCR扩增；
6)将步骤5)中的PCR产物进行具有尺寸选择性的纯化方式获得
具有特异长度的DNA文库，并根据测序仪要求的质控鉴定后进行高
通量测序。
2.如权利要求1所述的微量DNA中甲基化CpG岛高通量测序方法，
其特征在于：
其中，所述引物A的5’端序列可以与测序通用接头引物C相互
退火结合。
3.如权利要求1所述的微量DNA中甲基化CpG岛高通量测序方法，
其特征在于：
其中，所述引物B中5’端序列可以与接头引物D退火结合。
4.如权利要求1所述的微量DNA中甲基化CpG岛高通量测序方法，
其特征在于：
其中，所述引物B的3’端序列包含一段随机的长为5-15的碱
基的退火结合序列，此序列含有0-15个碱基C，0-15个碱基D与0-7
个CpG。
5.如权利要求1所述的微量DNA中甲基化CpG岛高通量测序方法，
其特征在于：
其中，所述引物B的3’端最后一个碱基为D(A、T、G混合
物)，第二、三个碱基紧接着一个CpG富集区，而在4～9个碱基则会
包含一个碱基C，其他的碱基为...

【专利技术属性】
技术研发人员：陆星宇，宋艳群，
申请(专利权)人：上海易毕恩基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31