一种细菌多糖修饰的重组融合蛋白的制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种细菌多糖修饰的重组融合蛋白的制备方法及其应用。本发明专利技术公开一种细菌多糖修饰的重组融合蛋白的制备方法，是将重组融合蛋白和脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶PglL在O-抗原连接酶基因缺陷的细菌中共表达，脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶PglL将细菌自身的多糖或外源多糖连接到重组融合蛋白上，得到细菌多糖修饰的重组融合蛋白。采用本发明专利技术的方法制备的细菌多糖修饰的重组融合蛋白免疫小鼠，可获得抗细菌多糖的特异性抗体，将这种细菌多糖修饰的重组融合蛋白用于细菌多糖蛋白结合疫苗的制备，可以避免病原菌培养的诸多问题，提高疫苗的均一性以及生产效率，降低疫苗制备的成本。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种多糖修饰蛋白的制备方法及其应用；特别涉及一种细菌多糖修饰的重组融合蛋白的制备方法及其应用，属于生物医药领域。
技术介绍
病原菌的O多糖(OPS)、荚膜多糖(CPS)等往往是其重要的保护性抗原，如大肠杆菌的O157型OPS，霍乱弧菌的O1型、O139型OPS，肺炎链球菌的4型、6B型、9V型、14型、18C型、19F型、23F型CPS等，金黄色葡萄球菌的CP5型和CP8型CPS，等等。许多针对多糖的抗体为病原菌的中和抗体，因此多糖疫苗的研发一直是细菌疫苗研发的重点之一。肺炎多糖疫苗、脑膜炎多糖疫苗、流感嗜血杆菌多糖疫苗、伤寒Vi多糖疫苗等一批多糖疫苗已经上市多年。但多糖疫苗的免疫记忆和免疫原性较弱，特别是在2岁以下儿童和老年人体内尤为突出。现在这类疫苗的研发重点已转向多糖-蛋白结合疫苗，其中7价肺炎多糖-蛋白结合疫苗、4价脑膜炎结合疫苗、b型流感嗜血杆菌结合疫苗已经上市，一批多糖-蛋白结合疫苗正处于不同的研发阶段。但是，多糖-蛋白结合疫苗采用化学法制备，包括以下步骤：①大规模培养病原菌(或其疫苗株)，从中提取多糖；②制备并提纯白喉、破伤风等毒素蛋白，灭活后作为载体蛋白；③通过化学方法交联多糖和载体蛋白；④再次纯化交联的多糖-蛋白结合物制备疫苗。该过程存在以下问题：①大规模培养病原菌弱毒的疫苗株提取多糖存在一定安全风险，有时需要负压厂房，而对烈性病原体，往往只有在获得病原菌的减毒株后，才能通过大规模培养提取多糖；②通过化学方法提取的多糖为混合物，纯度较低，质控困难，易引起副反应；③多糖与载体蛋白交联为随机过程，产物均一性差，纯化和质量控制困难；④生产过程步骤多，得率低，成本高。近些年来，随着测序技术和生物信息学的发展，在多种细菌中发现了天然的蛋白质糖基化修饰系统，如空肠弯曲弧菌的N-糖基化修饰系统、奈瑟球菌和绿脓杆菌的O-糖基化修饰系统，这些糖基化修饰系统中，多糖的合成途径与细菌的脂多糖和荚膜多糖的合成途径十分相似，多糖结构取决于糖基合成基因簇，而其寡糖转移酶对其转移的多糖专一性较低。其中空肠弯曲弧菌N-糖基化修饰系统中的寡糖转移酶PglB对多糖底物的要求为多糖还原末端第一位糖基的C2位必须有乙酰氨基，且第二位糖基不能以β(1-4)糖苷键与其连接。而脑膜炎奈瑟球菌O-糖基化修饰系统中的寡糖转移酶PglL对多糖底物无类似的要求，PglL能将还原末端第一位糖基C2位无乙酰氨基的多糖转移至蛋白的糖基化位点上，因此具有更广泛的应用前景。但目前关于PglL对蛋白底物特异性的研究较少，目前其已知的底物仅为奈瑟球菌菌毛蛋白PilE，这限制了其用于多糖修饰蛋白疫苗的制备。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种细菌多糖修饰的重组融合蛋白的制备方法及其应用。本专利技术提供一种细菌多糖修饰的重组融合蛋白的制备方法，是将重组融合蛋白和脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶PglL在O-抗原连接酶基因缺陷的细菌中共表达，脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶PglL将细菌自身的多糖或外源多糖连接到重组融合蛋白上，得到细菌多糖修饰的重组融合蛋白；所述重组融合蛋白含有N端信号肽、具有脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶PglL的糖基化位点的肽段和载体蛋白序列；所述载体蛋白为细菌毒素蛋白的无毒突变体或细菌毒素蛋白的部分片段；所述具有脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶PglL的糖基化位点的肽段位于所述载体蛋白序列的N端或C端；所述脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶PglL的氨基酸序列如SEQIDNo.26所示，或其具有类似功能的突变体；所述细菌多糖修饰的重组融合蛋白为细菌自身的多糖修饰的重组融合蛋白或外源多糖修饰的重组融合蛋白；所述O-抗原连接酶基因缺陷使得O抗原多糖不能连接到类脂A-核心寡糖上，从而不能形成脂多糖。上述方法中，所述信号肽可以是PelB、DsbA、STⅡ、OmpA、PhoA、LamB、SpA、Enx等信号肽，本专利技术采用的是DsbA信号肽，其氨基酸序列如SEQIDNo.32中自N端起第1位至第19位所示；所述脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶PglL的糖基化位点为脑膜炎奈瑟球菌菌毛蛋白PilE的自N端起第63位的丝氨酸；所述具有脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶PglL的糖基化位点的肽段为含有脑膜炎奈瑟球菌菌毛蛋白PilE的自N端起第63位丝氨酸的脑膜炎奈瑟球菌菌毛蛋白PilE的肽段，具体为至少含有脑膜炎奈瑟球菌菌毛蛋白PilE的自N端起第55至第66位氨基酸的任意肽段，更具体为如下任一所示：(1)SEQIDNo.32中自N端起第128位至第156位氨基酸所示的肽段或其串联重复序列；(2)SEQIDNo.34中自N端起第128位至第154位氨基酸所示的肽段或其串联重复序列；(3)SEQIDNo.36中自N端起第128位至第152位氨基酸所示的肽段或其串联重复序列；(4)SEQIDNo.38中自N端起第128位至第150位氨基酸所示的肽段或其串联重复序列；(5)SEQIDNo.40中自N端起第128位至第149位氨基酸所示的肽段或其串联重复序列；(6)SEQIDNo.48中自N端起第22位至第40位氨基酸所示的肽段或其串联重复序列；(7)SEQIDNo.50中自N端起第22位至第36位氨基酸所示的肽段或其串联重复序列；(8)SEQIDNo.52中自N端起第22位至第33位氨基酸所示的肽段或其串联重复序列。上述任一所述的方法中，所述细菌毒素蛋白的无毒突变体为绿脓杆菌外毒素蛋白A无毒突变体；所述细菌毒素蛋白的部分片段为霍乱毒素B亚单位或破伤风毒素C蛋白；所述绿脓杆菌外毒素A无毒突变体的氨基酸序列如SEQIDNo.46中自N端起第20位至第631位所示；所述霍乱毒素B亚单位的氨基酸序列如SEQIDNo.32中自N端起第20位至第122位所示；所述破伤风毒素C蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.60中自N端起第20位至第455位所示。上述任一所述的方法中，所述重组融合蛋白的氨基酸序列为如下任一所示：(1)SEQIDNo.32所示的氨基酸序列；(2)SEQIDNo.34所示的氨基酸序列；(3)SEQIDNo.36所示的氨基酸序列；(4)SEQIDNo.38所示的氨基酸序列；(5)SEQIDNo.40所示的氨基酸序列；(6)SEQIDNo.46所示的氨基酸序列；(7)SEQIDNo.48所示的氨基酸序列；(8)SEQIDNo.50所本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种细菌多糖修饰的重组融合蛋白的制备方法，是将重组融合蛋白和脑膜炎奈瑟球菌O‑寡糖转移酶PglL在O‑抗原连接酶基因缺陷的细菌中共表达，脑膜炎奈瑟球菌O‑寡糖转移酶PglL将细菌自身的多糖或外源多糖连接到重组融合蛋白上，得到细菌多糖修饰的重组融合蛋白；所述重组融合蛋白含有N端信号肽、具有脑膜炎奈瑟球菌O‑寡糖转移酶PglL的糖基化位点的肽段和载体蛋白序列；所述载体蛋白为细菌毒素蛋白的无毒突变体或细菌毒素蛋白的部分片段。

【技术特征摘要】
1.一种细菌多糖修饰的重组融合蛋白的制备方法，是将重组融合蛋白和脑膜炎
奈瑟球菌O-寡糖转移酶PglL在O-抗原连接酶基因缺陷的细菌中共表达，脑膜炎奈瑟
球菌O-寡糖转移酶PglL将细菌自身的多糖或外源多糖连接到重组融合蛋白上，得到
细菌多糖修饰的重组融合蛋白；
所述重组融合蛋白含有N端信号肽、具有脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶PglL的
糖基化位点的肽段和载体蛋白序列；
所述载体蛋白为细菌毒素蛋白的无毒突变体或细菌毒素蛋白的部分片段。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移
酶PglL的糖基化位点为脑膜炎奈瑟球菌菌毛蛋白PilE的自N端起第63位的丝氨酸；
所述具有脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶PglL的糖基化位点的肽段为含有脑膜炎
奈瑟球菌菌毛蛋白PilE的自N端起第63位丝氨酸的脑膜炎奈瑟球菌菌毛蛋白PilE
的肽段，具体为至少含有脑膜炎奈瑟球菌菌毛蛋白PilE的自N端起第55至第66位的
任意肽段，更具体为如下任一所示的肽段：
(1)SEQIDNo.32中自N端起第128位至第156位氨基酸所示的肽段或其串联
重复序列；
(2)SEQIDNo.34中自N端起第128位至第154位氨基酸所示的肽段或其串联
重复序列；
(3)SEQIDNo.36中自N端起第128位至第152位氨基酸所示的肽段或其串联
重复序列；
(4)SEQIDNo.38中自N端起第128位至第150位氨基酸所示的肽段或其串联
重复序列；
(5)SEQIDNo.40中自N端起第128位至第149位氨基酸所示的肽段或其串联
重复序列；
(6)SEQIDNo.48中自N端起第22位至第40位氨基酸所示的肽段或其串联重
复序列；
(7)SEQIDNo.50中自N端起第22位至第36位氨基酸所示的肽段或其串联重
复序列；
(8)SEQIDNo.52中自N端起第22位至第33位氨基酸所示的肽段或其串联重
复序列。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述细菌毒素蛋白的无毒突
变体为绿脓杆菌外毒素蛋白A无毒突变体；
所述细菌毒素蛋白的部分片段为霍乱毒素B亚单位或破伤风毒素C蛋白；
所述绿脓杆菌外毒素A无毒突变体的氨基酸序列如SEQIDNo.46中自N端起第
20位至第631位所示；
所述霍乱毒素B亚单位的氨基酸序列如SEQIDNo.32中自N端起第20位至第122
位所示；
所述破伤风毒素C蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.60中自N端起第20位至第455
位所示。
4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：所述重组融合蛋白的氨基
酸序列为如下任一所示：
(1)SEQIDNo.32所示的氨基酸序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴军，潘超，孙鹏，王恒樑，刘波，彭哲慧，朱力，唱韶红，巩新，冯尔玲，王斌，曾明，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11