本发明专利技术公开了一种可同时检测大菱鲆弧菌、创伤弧菌、副溶血弧菌和鱼肠道弧菌的LAMP方法。设计四组LAMP引物FIP，BIP，F3，B3，并在内引物添加不同酶切位点，配制含四种引物的LAMP反应体系，对LAMP扩增产物加入SYBR Green I进行检测。本发明专利技术比现有PCR技术检测大菱鲆弧菌、创伤弧菌、副溶血弧菌和鱼肠道弧菌的方法有更高的特异性、灵敏度、快速、便捷，并且可以用于现场的快速检测，有利于及时发现鱼类中大菱鲆弧菌、创伤弧菌、副溶血弧菌和鱼肠道弧菌的传染和爆发。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及大菱鲆弧菌、创伤弧菌、副溶血弧菌和鱼肠道弧菌的检测方法，具体涉及大菱鲆弧菌、创伤弧菌、副溶血弧菌和鱼肠道弧菌的多重LAMP检测方法。
技术介绍
大菱鲆弧菌(Vibrioscophthalmi)是一种革兰氏阴性菌，呈短杆状，现已知该菌是大菱鲆、牙鲆等重要经济鱼类的致病菌，病鱼症状为皮肤变黑、肝脏和小肠出血、并伴有腹水和腹胀；创伤弧菌(Vibriovulnificus)是一种革兰氏阴性嗜盐菌,主要分布于近海海洋环境中,是水产养殖虾、蟹和牡蛎等水生动物中最常见、流行最广、危害最严重的致病菌之一；副溶血弧菌(VibrioParahemolyticus)，为革兰氏阴性杆菌，呈弧状、杆状、丝状等多种形状，广泛存在于海水和海产品中,是我国沿海地区常见的食物中毒病原菌；鱼肠道弧菌(Vibrioichthyoenteri)是水产养殖中新发现的一种革兰氏阴性致病菌,呈杆状,两端钝圆,散在或成双,无芽孢,可感染大菱鲆(Scophthalmusmaximus)、牙鲆(Paralichthysolivaceus)、石鲽(Kareiusbicoloratus)等多种名贵海水养殖鱼类，造成严重的经济损失。目前，针对大菱鲆弧菌、创伤弧菌、副溶血弧菌和鱼肠道弧菌的检测技术主要是PCR法、DNA杂交法和菌落杂交法。然而，由于这些方法通常需要昂贵的仪器设备，且操作繁琐、费时费力，很难推广应用。环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)是2000年由Notomi等人专利技术的一种新的病原核酸检测技术，该技术根据靶序列设计四条特异性引物，可以特异性识别靶序列的六个特定区域，在等温条件下，通过BstDNA聚合酶的链置换和链延伸作用，可以在1小时内对靶序列实现109倍的扩增，扩增产物加入荧光染料SYBRGreenI后，阳性结果变为绿色，阴性无变化，可以通过肉眼直接观察。已经有关于创伤弧菌和副溶血弧菌的单重LAMP检测方法，但多重LAMP比单重LAMP更加快速、简便等特点，适合基层养殖场对病原的快速检测。然而，由于引物之间的相互干扰、多重LAMP检测条件的优化、以及检测结果分析等方面的难度和复杂性，至今尚未有报道能同时检测所述四种水产养殖致病菌的多重LAMP方法。
技术实现思路
本专利技术提供了一种大菱鲆弧菌、创伤弧菌、副溶血弧菌和鱼肠道弧菌的多重LAMP的检测方法，目的是实现对大菱鲆弧菌、创伤弧菌、副溶血弧菌和鱼肠道弧菌进行特异、灵敏、快速、简便的现场检测。改善原有检测技术繁琐、费时的弊端。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案予以实现：1、提供4组LAMP引物序列，大菱鲆弧菌长度分别为49bp，43bp，18bp，20bp的核苷酸序列，分别命名为luxR-FIP、luxR-BIP、luxR-F3、luxR-B3；创伤弧菌长度分别为45bp，46bp，20bp，19bp的核苷酸序列，分别命名为metalloprotease-FIP、metalloprotease-BIP、metalloprotease-F3、metalloprotease-B3；长度分别为47bp，44bp，19bp，22bp的核苷酸序列，分别命名为ompA-FIP、ompA-BIP、ompA-F3、ompA-B3；鱼肠道弧菌长度分别为46bp，46bp，18bp，19bp的核苷酸序列，分别命名为ToxR-FIP、ToxR-BIP、ToxR-F3、ToxR-B3。2、配置LAMP反应体系，通过LAMP反应程序对单一样品模板进行扩增，四种引物按比例加入，确定最佳反应体系和反应条件；3、反应产物的鉴定：2％琼脂糖凝胶电泳；酶切分析；产物加入SYBRGreenI,观察反应管中颜色变化。具体包括如下步骤：1、设计LAMP引物：根据GeneBank中已知的大菱鲆弧菌luxR基因(GenBank:JN684209.1)，创伤弧菌的metalloprotease基因(GenBank:U50548.1)，副溶血弧菌的ompA基因(GenBank:JTGT01000603.1)和鱼肠道弧菌的ToxR基因(GenBank:KT265743)作为靶序列，通过PrimerExploreV4在线设计软件设计四条特异性引物,对于大菱鲆弧菌，在FIP的F1c和F2之间添加EcorI酶切位点，在BIP的B1c和B2之间添加-TTTT-连接子；对于鱼肠道弧菌，在FIP的F1c和F2之间添加EcorV酶切位点，在BIP的B1c和B2之间添加-TTTT-连接子,对于V.vulnificus，在BIP的B1c和B2之间添加BamHI酶切位点，在FIP的F1c和F2之间添加-TTTT-连接子；V.parahaemolyticus，在BIP的B1c和B2之间添加PstI酶切位点，在FIP的F1c和F2之间添加-TTTT-连接子，设计以下四组LAMP引物：表1：多重LAMP引物组2、配制LAMP反应体系LAMP反应体系各组分含量：总体系25μl,包括BstDNA聚合酶1μl(8000U)，10×BstDNABuffer2.5μl，PCR级甜菜碱4μl(5M)，dNTPs(2.5mMeach)2.5μl,DNA模板1μl，FIP/BIP各0.5μl(1.6μM)，F3/B3各0.5μl(0.4μM)，加双蒸水使反应体系总体积达到25μl。3、LAMP反应体系扩增：将上述反应体系进行扩增反应，反应温度58到65℃，反应时间为15到90min.4、扩增产物检测：2％琼脂糖凝胶电泳；酶切分析；产物加入SYBRGreenI,观察反应管中颜色变化。本专利技术提供的同时检测四种致病菌的多重LAMP检测方法，有以下优势：一、灵敏度高对创伤弧菌和副溶血弧菌的检测可低至8CFU/μl,比普通PCR高100—1000倍。二、特异性强所需的特异性引物分别根据大菱鲆弧菌luxR基因、创伤弧菌的metalloprotease基因、副溶血弧菌的ompA基因和鱼肠道弧菌的ToxR基因的六个不同区域进行设计，特异性比常规PCR强。三、检测时间短1h左右即可获得检测结果，比普通PCR省时。四、仪器设备要求低不需要PCR仪等昂贵仪器，产物可以进行电泳，也可以直接加入SYBRGreenI染料，观察颜色变化，从而确定反应与否。五、操作简单、结果易观察：整个检测过程不涉及复杂仪器设备，产物加入SYBRGreenI染料，可以直接用肉眼观察判断。综上所述，本专利技术具有比现有的PCR技术检测大菱鲆弧菌、创伤弧菌、副溶血弧菌和鱼肠道弧菌的方法，有更高的特异性、本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测大菱鲆弧菌、创伤弧菌、副溶血弧菌和鱼肠道弧菌的多重LAMP引物组，其包括以下引物：四条特异性检测大菱鲆弧菌luxR基因的引物、四条特异性检测创伤弧菌metalloprotease基因的引物、四条特异性检测副溶血弧菌ompA基因的引物、以及四条特异性检测鱼肠道弧菌ToxR基因的引物。
【技术特征摘要】
1.一种检测大菱鲆弧菌、创伤弧菌、副溶血弧菌和鱼肠道弧菌的多重LAMP引物组，其包
括以下引物：四条特异性检测大菱鲆弧菌luxR基因的引物、四条特异性检测创伤弧菌
metalloprotease基因的引物、四条特异性检测副溶血弧菌ompA基因的引物、以及四条特异
性检测鱼肠道弧菌ToxR基因的引物。
2.如权利要求1所述的多重LAMP引物组，其特征在于：
特异性检测大菱鲆弧菌luxR基因的LAMP引物为：
luxR-F3AGCAAAAAGACCCCGCAC
luxR-B3CGGTTTCGTTCTCGGTGTT
luxR-FIP
GGCGCGCAAATACATCCAGAGAA-GAATTC-GACTCTCGCCCAAAAAACGT
luxR-BIPGTGGGATTGGTCGTGGTGGT-TTTT-ATACCGTGGCGACCGATAC；
特异性检测创伤弧菌metalloprotease基因的LAMP引物为：
metalloprotease-F3TCAGCAAACCTATTTGGGCC
metalloprotease-B3GTCTTCACGTGTTGGGAAGT
metalloprotease-FIP
CCATGCACATTGCTCAACCCTG-TTTT-CCTGTGTTTGATACCGCCG
metalloprotease-BIP
GATCAGCAACAAGCCATCGCC-GGATCC-TACGATTGGCATGCTTCGC；
特异性检测副溶血弧菌的ompA基因的LAMP引物为：
ompA-F3AATTACGCGGAAAGAAACC
ompA-B3GAGGCTTATTTCAATAACATGC
ompA-FIPAGCGGTAGGTTACTCATCCTCTAA-TTTT-GGATCGCTTCTCATCTTCA
ompA-BIPTTACCCACCCGTAGTGTTCG-CTGCAG-CAATCGAGAACTCGTGCC；
特异性检测鱼肠道弧菌ToxR基因的LAMP引物为：
ToxR-F3TTTGCCGCTCAGCTA...
【专利技术属性】
技术研发人员：周顺，高志鑫，张敏，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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