一种快速分离鉴定与保存甘薯白绢病菌的方法技术

本发明专利技术公开了一种快速分离鉴定与保存甘薯白绢病菌的方法，包括以下步骤：1)从甘薯白绢病的病样中挑取菌丝或菌核接种于PDA培养基平板置于20～30℃进行培养；2)待PDA培养基平板长出新的菌丝后，挑取新的菌丝到新的PDA培养基平板上，进行纯化培养；3)将所述纯化的菌株在20～30℃条件下培养2～4d后，将菌丝块作为接种体接种至健康甘薯茎枝，以PDA块作为空白对照，在密封条件下，20～30℃培养1～3天，出现茎枝腐烂的现象确认为甘薯白绢病菌；4)接着对甘薯白绢病菌进行菌核培养，然后将菌核干燥并存放。本发明专利技术所述的方法，可实现甘薯白绢病菌的快速分离鉴定保存菌种过程简单，工作量小，效率高，保藏菌种易管理，保存的菌种存活时间长，可达4年以上。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及微生物的分离鉴定和保存
，尤其涉及一种快速分离鉴定与保存甘薯白绢病菌的方法。
技术介绍
甘薯白绢病是由齐整小核菌(SclerotiumrolfsiiSacc.)引起的，从甘薯育苗期至收获期均可能发生，发病田块甘薯产量损失达20％以上，严重者甚至绝收。甘薯储藏或销售时，白绢病菌常导致薯蒂和薯尾腐烂，影响甘薯的品质和商品性。现阶段甘薯白绢病的危害已成为甘薯产业的一个重要限制因素，对甘薯白绢病的发生规律，病原菌的生物学性状、对杀菌剂的敏感性和对甘薯的致病性等进行研究，寻找理想的防控方法成为甘薯产业防治病害的重中之重。然而，开展病害所有研究的最基础最根本工作是病原菌的分离鉴定与保存，可靠的病原菌分离鉴定和保存技术是病害防控技术研究的保证。目前甘薯白绢病菌通常的分离步骤包括：首先用水将病样表面的泥沙冲洗干净，在室内晾干后，选择病样病健交界部位作为分离材料，在超净台用接种刀切成小块，经酒精或者升汞消毒后，用无菌水清洗2-3次后，用灭菌的镊子将切块放在PDA上置于25℃培养，待长出菌落后，对长出真菌进行纯化，纯化后还需要接种鉴定进行确认。作为常用的分离方法在病原菌的分离起到了极大的作用，然而通常存在，选取病健交界处材料具有一定不确定性，选择不好则分离不到病原菌；此外不同的材料所需消毒时间不同，消毒时间太长容易将病原菌杀死或者消毒时间太短分离后出现大量的细菌或其他真菌，导致分离不到病原菌或需要大量的纯化鉴定工作。因此，该分离方法需要有一定经验、步骤较多、存在分离不到病原菌的风险。白绢病病原菌最常用的保存方法是将接种到PDA斜面上或者PDA培养基平板上白绢病菌放置在4℃冰箱进行低温保存，该保存方法简单有效，不需要特殊处理，但是一般只能保存2-3月，因此需要对白绢病菌不断重新转接培养保存。然而，多次转接培养保存易导致菌种的污染和致病性减弱，当菌种数量较多时，菌种保存的工作量较大，易造成菌种的错乱甚至丢失。因此，有必要建立一种简单的快速分离和保存甘薯白绢病菌的方法。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种简单的快速分离鉴定和保存甘薯白绢病菌的方法。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种快速分离鉴定甘薯白绢病菌的方法，包括以下步骤：1)在甘薯白绢病的病样中挑取菌丝和/或菌核接种于PDA培养基平板，在20～30℃条件下进行培养，所述的甘薯白绢病的病样为具有白色如白绢状的菌丝和/或白色至棕褐色的油菜籽状的菌核的甘薯薯块或茎枝；2)培养出新的菌丝后，挑取新的菌丝到新的PDA培养基平板上，进行纯化培养，纯化培养长出新的菌丝后重复挑取新的菌丝至新的PDA培养基平板，多次重复培养得到纯化的菌株，然后将纯化的菌株培养8～12天，得到具有油菜籽状菌核的菌株即为纯化的疑似甘薯白绢病菌；3)将所述纯化的疑似甘薯白绢病菌菌株在20～30℃培养2～4d后，从菌落上切取菌丝块作为接种体接种至健康甘薯茎枝，在密封条件下，20～30℃培养1～3天，以PDA培养基块作为空白对照，出现茎枝腐烂的现象确认接种到甘薯茎枝上的菌株为甘薯白绢病菌。优选的，步骤1)中所述的PDA培养基平板包括链霉素。优选的，_步骤1)中所述PDA培养基平板中链霉素的终浓度为15～25mg/L。优选的，链霉素是在步骤1)中所述的PDA培养基冷却至50～60℃间加入的。优选的，所述的链霉素与PDA培养基的质量比为(0.05～0.2):100。优选的，步骤3)中所述的菌丝块取自菌落边缘0～20mm范围内。优选的，所述的菌丝块的直径为4～8mm。优选的，步骤3)中所述的健康甘薯茎枝的长度为10～15cm，所述的健康甘薯茎枝平置于铺有浸透无菌水的滤纸的密闭塑料盒内。优选的，步骤3)中所述的接种是将菌丝块的有菌面贴住健康甘薯茎枝接种。本专利技术还提供了一种保存甘薯白绢病菌的方法，包括以下步骤：将甘薯白绢病菌转接到新的PDA培养基平板上，20～30℃培养至平板上长出棕褐色的菌核，在无菌条件下，收集棕褐色的菌核；菌核干燥后放入-30℃～-20℃保存。本专利技术的有益效果：本专利技术所述的方法不需要进行酒精或升汞消毒，提高了病原菌分离效率，减少了有害物的处理；分离鉴定不需要特殊的仪器设备；鉴定速度快，接种两天内就可确认是否为致病白绢病。本专利技术还提供了甘薯白绢病菌的保存方法，通过保存干燥的菌核可实现保存的菌种存活时间长，可达4年以上；本专利技术提供的保存方法工作量小，保藏菌种易管理。附图说明图1为本专利技术实施例1中甘薯白绢病菌培养3天的菌落状态；图2为本专利技术实施例中甘薯白绢病菌培养10天的菌落状态。具体实施方式本专利技术提供了一种快速分离鉴定甘薯白绢病菌的方法，包括以下步骤：1)在甘薯白绢病的病样中挑取菌丝或菌核接种于PDA培养基平板20～30℃进行培养，所述的甘薯白绢病的病样为具有白色如白绢状的菌丝和白色至棕褐色的油菜籽状的菌核的甘薯；2)培养出新的菌丝后，挑取新的菌丝到新的PDA培养基平板上，进行纯化培养，纯化培养长出新的菌丝后重复挑取新的菌丝至新的PDA培养基平板，多次重复培养得到纯化的菌株，然后将纯化的菌株培养8～12天，得到具有油菜籽状菌核的菌株即为纯化的疑似甘薯白绢病菌；3)将所述纯化的疑似甘薯白绢病菌菌株在20～30℃培养2～4d后，从菌落上切取菌丝块作为接种体接种至健康甘薯茎枝，以PDA培养基块作为空白对照，在密封条件下，20～30℃培养1～3天，出现茎枝腐烂的现象确认接种到甘薯茎枝上的菌株为甘薯白绢病菌。本专利技术优选在分离鉴定甘薯白绢病菌之前制备PDA培养基，本专利技术中所述的PDA培养基为本领域技术人员所熟知的PDA培养基，本专利技术对此没有特殊的限制。本专利技术所述的PDA培养基优选的经过高温灭菌，所述的高温灭菌采用本领域所熟知的湿热高温灭菌即可，无其他特殊要求。本专利技术优选在对PDA培养基高温灭菌后冷却，优选在所述冷却的过程中加入链霉素。优选的所述链霉素在PDA培养基冷却至50～60℃，更优选的在PDA培养基冷却至55℃时添加。在本专利技术中，所述PDA培养基中链霉素的浓度优选的为15～25mg/L，更优选的为20mg/L；所述链霉素与PDA培养基的质量比优选的为(0.05～0.2):100，更优选的为0.1:100。本专利技术在PDA培养基制备完成后，进行甘薯白绢病菌的分离：在甘薯白绢病的病样中挑取菌丝或菌核接种于PDA培养基平板本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速分离鉴定甘薯白绢病菌的方法，包括以下步骤：1)从甘薯白绢病的病样中挑取菌丝和/或菌核接种于PDA培养基平板，在20～30℃条件下进行培养，所述的甘薯白绢病的病样为具有白色如白绢状的菌丝和/或白色至棕褐色的油菜籽状的菌核的甘薯薯块或茎枝；2)培养出新的菌丝后，挑取新的菌丝到新的PDA培养基平板上，进行纯化培养，纯化培养长出新的菌丝后重复挑取新的菌丝至新的PDA培养基平板，多次重复培养得到纯化的菌株，将所述纯化的菌株培养8～12天，得到具油菜籽状菌核的菌株即为纯化的疑似甘薯白绢病菌；3)将所述纯化的疑似甘薯白绢病菌菌株在20～30℃培养2～4d后，从菌落上切取菌丝块作为接种体接种至健康甘薯茎枝，在密封条件下，20～30℃培养1～3天，以PDA培养基块，作为空白对照，出现茎枝腐烂的现象确认接种到甘薯茎枝上的菌株为甘薯白绢病菌。

【技术特征摘要】
1.一种快速分离鉴定甘薯白绢病菌的方法，包括以下步骤：
1)从甘薯白绢病的病样中挑取菌丝和/或菌核接种于PDA培养基平板，
在20～30℃条件下进行培养，所述的甘薯白绢病的病样为具有白色如白绢状
的菌丝和/或白色至棕褐色的油菜籽状的菌核的甘薯薯块或茎枝；
2)培养出新的菌丝后，挑取新的菌丝到新的PDA培养基平板上，进行
纯化培养，纯化培养长出新的菌丝后重复挑取新的菌丝至新的PDA培养基平
板，多次重复培养得到纯化的菌株，将所述纯化的菌株培养8～12天，得到具
油菜籽状菌核的菌株即为纯化的疑似甘薯白绢病菌；
3)将所述纯化的疑似甘薯白绢病菌菌株在20～30℃培养2～4d后，从菌
落上切取菌丝块作为接种体接种至健康甘薯茎枝，在密封条件下，20～30℃培
养1～3天，以PDA培养基块，作为空白对照，出现茎枝腐烂的现象确认接种
到甘薯茎枝上的菌株为甘薯白绢病菌。
2.根据权利要求1所述快速分离鉴定甘薯白绢病菌的方法，其特征在于：
步骤1)中所述的PDA培养基平板包括链霉素。
3.根据权利要求2所述的快速分离鉴定甘薯白绢病菌的方法，其特征在
于：步骤1)中所述PDA培养基平板中链霉素的浓度为15～25mg/L。
4.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄立飞，房伯平，陈景益，叶芍君，黄实辉，
申请(专利权)人：广东省农业科学院作物研究所，
类型：发明
国别省市：广东;44