一种MBP融合肝素酶Ⅱ及其编码基因与制备方法技术

本发明专利技术公开了一种MBP融合肝素酶Ⅱ，该MBP融合肝素酶Ⅱ是如下a）或b）的蛋白：a）序列表中序列1的氨基酸序列组成的蛋白；b）序列表中序列1氨基酸序列经过对构成MBP融合肝素酶Ⅱ蛋白中肝素酶Ⅱ二聚体结合面的33个氨基酸位点中的一个或多个定点突变的蛋白。上述蛋白的编码基因及制备方法也属于本发明专利技术的保护范围。本发明专利技术通过基因工程手段对MBP融合肝素酶Ⅱ进行定点突变，最终获得催化活性及热稳定性都明显提高的MBP融合肝素酶Ⅱ。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程和发酵工程领域，特别涉及一种MBP融合肝素酶Ⅱ及其编码基因与制备方法。
技术介绍
肝素酶（heparinase）是一类作用于肝素（heparin）或者硫酸乙酰肝素（heparansulfate）的多糖裂解酶，来自肝素黄杆菌的肝素酶主要有肝素酶Ⅰ(EC4.2.2.7)，肝素酶Ⅱ（NoECcode）与肝素酶Ⅲ（EC4.2.2.8）。相比于肝素酶Ⅰ和Ⅲ，肝素酶Ⅱ具有范围更广的底物与作用位点，产物的种类和组成也更加多样，这一特性使其具备更高的多糖降解效率，在低分子量肝素的制备以及肝素精确结构分析中具有重要的作用。由于肝素酶Ⅱ的重要应用价值，研究人员一直致力于通过分子改造来改善肝素酶Ⅱ的催化性能。2009年，Lien-IHor等（Lien-IHor,HowardA.Shuman，GeneticanalysisofperiplasmicbindingproteindependenttransportinEscherichiacoli.JMolBiol,1993,233:659-670）对不同来源的肝素酶Ⅱ的一级序列及高级结构进行分析，发现改变肝素酶Ⅱ中几处较保守的氨基酸残基Glu207和His411的电荷性质，可以有效提高肝素酶Ⅱ对硫酸乙酰肝素的亲和能力，但没有对催化性能产生明显的作用。2010年，DavidShaya等（DavidShaya,WenjingZhao,Marie-LineGarron,ZhongpingXiao,QizhiCui,ZhenqingZhang,TraianSulea,RobertJLinhardt,MiroslawCygler.CatalyticmechanismofheparinaseIIinvestigatedbysite-directedmutagenesisandthecrystalstructurewithitssubstrate.JBiolChem.2010，285(26):20051-61.）根据晶体结构信息，对催化中心区域的氨基酸残基Tyr257，His202，和His406进行了定点突变，研究发现：在众多氨基酸替换策略中，Y257F表现的酶活性最高，而H406A表现的酶活性最低；该趋势在对底物降解程度上也是相同的：Y257F能够彻底降解底物，而H406A几乎完全失去降解活性。由此可见，目前肝素酶Ⅱ酶催化能力及热稳定性没有显著提高，并且缺乏通过基因工程手段大幅度提高肝素酶Ⅱ催化活性及热稳定性的有效方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种MBP融合肝素酶Ⅱ。本专利技术所提供的MBP融合肝素酶Ⅱ是如下a）或b）的蛋白：a）序列表中序列1的氨基酸序列组成的蛋白；b）序列表中序列1氨基酸序列经过对构成MBP融合肝素酶Ⅱ蛋白中肝素酶Ⅱ二聚体结合面的33个氨基酸位点中的一个或多个定点突变的蛋白，其中可选的33个氨基酸位点为PRO615、HIS617、PHE649、ASN650、PRO651、GLY652、GLN654、PHE655、TYR658、TYR701、ARG731、ASP735、LEU736、PRO737、ARG740、TYR741、PHE882、ASN886、ARG1081、PRO1082、LEU1101、THR1104、GLN1106、ILE1113、PRO1116、ALA1117、LEU1118、SER1119、LYS1121、GLY1122、ASP1123、LEU1139、ARG1140。上述MBP融合蛋白的编码基因，是如下a）或b）核苷酸序列：a）基因序列是序列表中序列2所示的核苷酸序列；b）基因序列是编码序列表中序列1氨基酸序列的核苷酸序列，或是编码序列表中序列1氨基酸序列经过对构成MBP融合肝素酶Ⅱ蛋白中肝素酶Ⅱ二聚体结合面的33个氨基酸位点中的一个或多个定点突变的蛋白的核苷酸序列。本专利技术的另一个目的在于提供一种MBP融合肝素酶Ⅱ的制备方法：稀有密码子优化法和/或定点突变改造法。所述的稀有密码子优化法：将来自肝素黄杆菌的肝素酶Ⅱ的编码区序列，按照“大肠杆菌密码子使用偏好”进行优化，得到优化后肝素酶Ⅱ序列；将序列优化后的肝素酶Ⅱ序列与MBP标签构建融合蛋白表达载体，再进行MBP融合肝素酶Ⅱ的表达，得到MBP融合肝素酶Ⅱ蛋白。所述的来自肝素黄杆菌的肝素酶Ⅱ编码区序列为序列表中序列3。所述的优化后肝素酶Ⅱ序列为序列表中序列4。上述的定点突变改造法是将MBP融合肝素酶Ⅱ中的肝素酶Ⅱ氨基酸序列758位即MBP融合肝素酶Ⅱ氨基酸序列（序列表中序列1）中的1126位，定点突变为Ile（CTG），Val（GTG），Ser（AGC），Thr（ACC），Glu（GAA），Gly（GGC），Phe（GCC），Tyr（TTA）之一。所述的定点突变改造法还可以是对构成MBP融合肝素酶Ⅱ蛋白中的肝素酶Ⅱ二聚体结合面的33个氨基酸位点中的一个或多个定点进行定点突变的方法。来自肝素黄杆菌中的肝素酶Ⅱ基因不适合在大肠杆菌系统中单独表达，本专利技术采用稀有密码子优化法，按照“大肠杆菌密码子使用偏好”进行优化，序列优化后肝素酶Ⅱ与MBP标签融合，MBP融合肝素酶Ⅱ在大肠杆菌的表达效率得到了明显的提高，优化前MBP融合肝素酶Ⅱ在总蛋白中所占比例为23.9%，优化后MBP融合肝素酶Ⅱ在总蛋白中所占比例为36.9%。在此基础上进行定点突变改造，尤其对MBP融合肝素酶Ⅱ氨基酸1126位进行突变改造，实验表明该突变位点距离底物结合、催化位点较远，不影响该酶的底物降解机制，通过突变得到了催化活性及热稳定性都明显提高的MBP融合肝素酶Ⅱ，尤其是得到催化活性及热稳定性较佳HepB（1126L）和HepB（1126T）。HepB（1126L）在大肠杆菌中表达的MBP融合肝素酶Ⅱ酶活可达9000IU/L，表达量可达1.83g/L，比酶活可达4.78IU/mg，在最适反应温度30℃的酶活半衰期达到200小时左右；HepB（1126T）在大肠杆菌中表达的MBP融合肝素酶Ⅱ酶活可达5921IU/L，表达量可达0.8g/L，比酶活可达7.4IU/mg，在最适反应温度30度下的酶活半衰期达到40小时左右。本专利技术可以实现MBP融合肝素酶Ⅱ催化活性及热稳定性的大幅度提升，并且该突变并不影响该酶的底物降解机制（距离底物结合、催化位点较远），是一种快速、稳定、高效、安全的分子改造策略。附图说明图1肝素酶Ⅱ稀有密码子图。图2肝素酶Ⅱ编码区序列密码子优化前后的使用频率图。图3序列优化后的肝素酶Ⅱ的MBP融合表达载体构建图。图4SDS-PAGE电泳图；其中，泳道1、8：Marker；泳道2：阴性对照；泳道3：总蛋白；泳道4：可溶蛋白；泳道5：不可溶蛋白；泳道6：纯化后肝素酶II；泳道7：纯化过程流过液。图5HepB（1126P）和HepB（1126A）热稳定性差异比较。图6HepB（1126P）和HepB（1126A）降解肝素后的产物分析比对（6A、6B、6C）：...

【技术保护点】
一种MBP融合肝素酶Ⅱ，是如下a）或b）的蛋白：a）序列表中序列1的氨基酸序列组成的蛋白；b）序列表中序列1氨基酸序列经过对构成MBP融合肝素酶Ⅱ蛋白中肝素酶Ⅱ二聚体结合面的33个氨基酸位点中的一个或多个定点突变的蛋白，其中可选的33个氨基酸位点为序列表中序列1中的PRO615、HIS617、PHE649、ASN650、PRO651、GLY652、GLN654、PHE655、TYR658、TYR701、ARG731、ASP735、LEU736、PRO737、ARG740、TYR741、PHE882、ASN886、ARG1081、PRO1082、LEU1101、THR1104、GLN1106、ILE1113、PRO1116、ALA1117、LEU1118、SER1119、LYS1121、GLY1122、ASP1123、LEU1139、ARG1140。

【技术特征摘要】
1.一种MBP融合肝素酶Ⅱ，是如下a）或b）的蛋白：
a）序列表中序列1的氨基酸序列组成的蛋白；
b）序列表中序列1氨基酸序列经过对构成MBP融合肝素酶Ⅱ蛋白中肝素酶Ⅱ二聚体结合面的33个氨基酸位点中的一个或多个定点突变的蛋白，其中可选的33个氨基酸位点为序列表中序列1中的PRO615、HIS617、PHE649、ASN650、PRO651、GLY652、GLN654、PHE655、TYR658、TYR701、ARG731、ASP735、LEU736、PRO737、ARG740、TYR741、PHE882、ASN886、ARG1081、PRO1082、LEU1101、THR1104、GLN1106、ILE1113、PRO1116、ALA1117、LEU1118、SER1119、LYS1121、GLY1122、ASP1123、LEU1139、ARG1140。
2.一种MBP融合肝素酶Ⅱ的编码基因，是如下a）或b）核苷酸序列：
a）基因序列是序列表中序列2所示的核苷酸序列；
b）基因序列是编码序列表中序列1氨基酸序列的核苷酸序列，或是编码序列表中序列1氨基酸序列经过对构成MBP融合肝素酶Ⅱ蛋...

【专利技术属性】
技术研发人员：邢新会，苏楠，张翀，
申请(专利权)人：清华大学无锡应用技术研究院，
类型：发明
国别省市：江苏;32