本发明专利技术涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种软枣猕猴桃L‑半乳糖内酯脱氢酶基因及其表达方法。本发明专利技术所用的软枣猕猴桃品种为“魁绿”。本发明专利技术包括(1)克隆一种软枣猕猴桃L‑半乳糖内酯脱氢酶基因；(2)提供该基因及其编码蛋白的序列；(3)提供将该基因表达载体的构建方法；(4)提供该基因在大肠杆菌中的表达方法。通过对软枣猕猴桃L‑半乳糖内酯脱氢酶基因的研究，可为进一步开展软枣猕猴桃AsA代谢分子机制奠定基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，具体而言，涉及一种软枣猕猴桃L-半乳糖内酯脱氢酶基因及其表达方法。
技术介绍
维生素C(VitaminC)，又叫L-抗坏血酸(L-ascorbicacid，AsA)是植物和大多数动物体内合成的一类高丰度己糖内酯化合物。由于人类缺乏其合成关键酶无法自身合成与储存维生素C而只能从食物中获取，因此AsA含量已成为衡量农产品品质的重要指标。前人研究表明植物Vc可能存在4条合成途径：L-半乳糖途径、糖醛酸途径、L-古洛糖途径和肌醇途径，其中以Smirnoff-Wheeler提出的L-半乳糖途径占主导地位。该途径中，L-半乳糖内酯脱氢酶(GalLDH)直接氧化半乳糖内酯形成AsA，起着关键酶的作用，是所有合成相关酶中研究的比较多的一个。软枣猕猴桃[Actinidiaarguta(Sieb.etZucc.)Planch.exMiq.]为猴桃科(Actinidiaceae)猴桃属(Actinidia)多年生落叶木质藤本果树，广泛分布于我国东北、华北、西北及长江流域，朝鲜、日本，俄罗斯亦有分布，但以我国东北三省的资源最为丰富，软枣猕猴桃果实品质优良、酸甜适口，风味独特，营养丰富，富含维生素含量高达4.3mg/g。较高的Vc含量可能预示其存在特殊的合成机制，到目前为止，GalLDH基因已从茶树(NCBI登陆号KF619448.1)、美味猕猴桃(NCBI登陆号GU339039.1)、毛花猕猴桃(NCBI登陆号HM237180.1)等植物中得到克隆，但软枣猕猴桃中却未见报道，这对进一步深入了解软枣猕猴桃L-半乳糖内酯脱氢酶的基因基础、进一步开展软枣猕猴桃AsA代谢分子机制带来了很大阻碍。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种软枣猕猴桃L-半乳糖内酯脱氢酶基因及其表达方法。本专利技术所用的软枣猕猴桃品种为“魁绿”。本专利技术包括(1)克隆一种软枣猕猴桃L-半乳糖内酯脱氢酶基因；(2)提供该基因及其编码蛋白的序列；(3)提供将该基因表达载体的构建方法；(4)提供该基因在大肠杆菌中的表达方法。为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：一种自软枣猕猴桃提取的L-半乳糖内酯脱氢酶基因，所述L-半乳糖内酯脱氢酶基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。应当理解，本领域人员可根据本专利技术公开的软枣猕猴桃L-半乳糖内酯脱氢酶基因的核苷酸序列(SEQIDNO:1)，在保证其活性的前提下，取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸，得到该基因的突变序列。因此，本专利技术的软枣猕猴桃L-半乳糖内酯脱氢酶基因还包括SEQIDNO:1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸残基，具有与软枣猕猴桃L-半乳糖内酯脱氢酶基因编码的蛋白相同活性的L-半乳糖内酯脱氢酶基因衍生得到的基因。该基因全长2486bp，SEQIDNO:1所示的核苷酸序列是由1833个核苷酸组成的开放阅读框序列基因。本专利技术提供的软枣猕猴桃L-半乳糖内酯脱氢酶基因为首次克隆得到，其编码的L-半乳糖内酯脱氢酶的氨基酸序列也为第一次得到。本申请丰富了L-半乳糖内酯脱氢酶的研究领域，为进一步开展软枣猕猴桃AsA代谢分子机制奠定基础。本专利技术还提供上述编码权利要求所述的软枣猕猴桃L-半乳糖内酯脱氢酶基因编码的蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。SEQIDNO:2所示的氨基酸序列是由610个氨基酸残基组成的蛋白质，分子量为69309.5Da；等电点为8.54，负电荷残基(Asp+Glu)数为75个，正电荷残基(Arg+Lys)数为81个；不稳定系数为51.38，为不稳定蛋白质。扩增所述软枣猕猴桃L-半乳糖内酯脱氢酶基因的引物对，所述引物对的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示。可以软枣猕猴桃全基因组或本申请提供的重组质粒为模板，利用该引物对扩增出SEQIDNO:1所述的基因。如上所述的软枣猕猴桃L-半乳糖内酯脱氢酶基因的克隆方法，包括：1)、提取软枣猕猴桃总RNA，以此为模板进行反转录得到第一链cDNA；2)、根据Genbank中已登录的植物L-半乳糖内酯脱氢酶基因保守序列设计引物，以所述第一链cDNA为模板进行PCR扩增，将所得扩增产物测序得到软枣猕猴桃L-半乳糖内酯脱氢酶基因保守区序列；3)、根据所述软枣猕猴桃L-半乳糖内酯脱氢酶基因保守区序列设计3'-RACE引物和5'-RACE引物，以软枣猕猴桃总DNA为模板，利用cDNA末端快速扩增技术进行扩增，将扩增产物测序后通过生物信息学方法分析并去除载体序列，将5'-RACE和3'-RACE测序结果拼接获得cDNA全长；4)、通过生物信息学方法对获得的软枣猕猴桃L-半乳糖内酯脱氢酶全长cDNA序列进行开放阅读框分析从而得到目的基因所编码蛋白质的氨基酸序列。含有权利要求1所述基因的重组质粒。可选的，如上所述的重组质粒，所述重组质粒为将SEQIDNo:1所示的核苷酸插入到pMD18-T、pEASY或pET-28a(+)中得到。可选的，如上所述的重组质粒的构建方法：将SEQIDNO:1所示的基因片段连接到克隆载体pEASY上，得到pEASY-Gal；对pEASY-Gal进行扩增；将SEQIDNO:1所示基因片段从pEASY-Gal上酶切下来，连接到经过相同限制性内切酶切割的表达载体pET-28a(+)上，构建获得的重组质粒即为L-半乳糖内酯脱氢酶表达载体。本专利技术的一个实施例中，将核苷酸序列为SEQIDNO:1的基因片段连接到克隆载体pEASY中；再通过限制酶剪切并连接到表达载体pET-28a(+)中构建重组表达载体。本申请先将目的片段连接到克隆载体上，再酶切并与表达载体连接。此操作有主要两方面的原因：进克隆载体比进表达载体容易很多，可以尽快拿到目的片段，一旦克隆不成功，或者因为Taq酶的错配出现了碱基突变，会需要重复几次，样本即耗材都会大量消耗；克隆载体的最大优点是它一般都有成熟的筛选系统，这样在一些连接效率较低、特异性不强的时候容易筛选。含有权利要求4或5所述重组质粒的宿主细胞。可选的，所述宿主细胞为JM109或BL21(DE3)-T1R中的一种。这两种宿主细胞均为大肠杆菌。可选的，如上所述的重组质粒在BL21(DE3)-T1R细胞中表达制备重组蛋白的方法，包括以下步骤：将连接有SEQIDNo:1所本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种自软枣猕猴桃提取的L‑半乳糖内酯脱氢酶基因，其特征在于，所述L‑半乳糖内酯脱氢酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
【技术特征摘要】
1.一种自软枣猕猴桃提取的L-半乳糖内酯脱氢酶基因，其特征在于，
所述L-半乳糖内酯脱氢酶基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。
2.权利要求1所述的软枣猕猴桃L-半乳糖内酯脱氢酶基因编码的蛋白，
其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。
3.扩增权利要求1所述软枣猕猴桃L-半乳糖内酯脱氢酶基因的引物对，
其特征在于，所述引物对的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ
IDNO:3和SEQIDNO:4所示。
4.权利要求1所述的软枣猕猴桃L-半乳糖内酯脱氢酶基因的克隆方法，
其特征在于，包括：
1)、提取软枣猕猴桃总RNA，以此为模板进行反转录得到第一链cDNA；
2)、根据Genbank中已登录的植物L-半乳糖内酯脱氢酶基因保守序列
设计引物，以所述第一链cDNA为模板进行PCR扩增，将所得扩增产物测
序得到软枣猕猴桃L-半乳糖内酯脱氢酶基因保守区序列；
3)、根据所述软枣猕猴桃L-半乳糖内酯脱氢酶基因保守区序列设计
3'-RACE引物和5'-RACE引物，以软枣猕猴桃总DNA为模板，利用cDNA
末端快速扩增技术进行扩增，将扩增产物测序后通过生物信息学方法分析
并去除载体序列，将5'-RACE和3'-RACE测序结果拼接获得cDNA全长；
4)、通过生物信息学方法对获得的软枣猕猴桃L-半乳糖内酯脱氢酶全
长cDNA序列进行开放阅读框分析从...
【专利技术属性】
技术研发人员：张庆田，范书田，杨义明，李晓艳，艾军，
申请(专利权)人：中国农业科学院特产研究所，
类型：发明
国别省市：吉林;22
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