万寿菊细胞培养生产游离叶黄素的方法技术

万寿菊细胞培养生产游离叶黄素的方法，涉及植物细胞培养技术。按照下述步骤进行：(1)外植体诱导产生愈伤组织细胞；(2)经筛选建立万寿菊愈伤组织细胞系；(3)高产游离叶黄素的悬浮细胞培养系的建立；(4)悬浮细胞扩大培养用于游离叶黄素的生产；(5)细胞中游离叶黄素的提取和产率测定。本发明专利技术为一种生产叶黄素的新方法，能够连续生产，不受季节和外界环境的限制，可为临床药用提供新的来源；所获得的细胞产物直接为游离叶黄素，而非叶黄素酯，省去下游皂化反应步骤；细胞产物成分简单，杂质少，易于下游叶黄素的分离、纯化。

【技术实现步骤摘要】
万寿菊细胞培养生产游离叶黄素的方法
本专利技术涉及植物细胞培养技术，具体的说是利用万寿菊(TageteserectaL.)细胞培养生产游离叶黄素的方法。
技术介绍
叶黄素(IUPAC名：β,ε-carotene-3,3'-diol)是一种含氧的类胡萝卜素，英文名为lutein，CAS注册号：127-40-2，分子式为C40H56O2。叶黄素是构成人眼睛视网膜黄斑区域的主要色素，能够滤过蓝光和清除自由基，主要生理功能表现为防止光损伤和抗氧化。叶黄素具有预防和治疗某些眼科疾病的作用，尤其在预防年龄相关性黄斑变性和老年性白内障方面的作用明显。补充叶黄素可提高视网膜黄斑色素密度，防止视力退化和眼部生理结构及功能改变。叶黄素可作为预防和治疗眼科疾病的辅助药物应用于临床。但是，人体自身不能够合成叶黄素，只能从食物中摄取。2010年，叶黄素的全球市场约为2.33亿美元，而且，预计还会以每年3.6％的增速在增长，到2018年达到3.08亿美元(BBC，2011)。叶黄素分子内存在3个不对称中心，两个六元碳环由一个含有十八个碳原子的共轭长链相连接。由于叶黄素结构复杂，采用化学方法难以合成单一异构体的叶黄素。目前，商业化生产的叶黄素主要是从万寿菊花中提取。然而，大规模栽培万寿菊，存在占地面积大、生产效率低等问题，而且受到季节、气候以及地域等条件的限制。基于此，迫切需要发展新的技术来解决叶黄素的来源。利用植物细胞培养技术生产具有生物活性的天然化合物，优势主要表现在目标化合物的生产是在限定的可控条件下完成的，独立于气候变化和土壤条件，可以更好的控制产品的质量和产量。商业化生产用于制药工业的天然化合物需满足以下三个方面的要求：第一，生产成本低；第二，生产体系可靠、可持续生产；第三，生产过程环境安全。与直接从原植物中提取以及化学合成相比较，利用植物细胞培养技术生产天然化合物能够更好地满足以上三点要求，是未来的发展方向。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种生产叶黄素的新方法，具体地说是万寿菊细胞培养生产游离叶黄素的方法。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：1.将来自万寿菊植株的外植体清洗干净、灭菌，接种于愈伤组织诱导培养基上，诱导产生愈伤组织细胞。外植体为新鲜万寿菊花的花瓣。愈伤组织诱导培养基为MS(MurashigeandSkoog，1962)基础培养基，添加终浓度0.1～5mg/L1-萘乙酸(1-Naphthaleneaceticacid)，0.1～5mg/L6-苄氨基嘌呤(6-Benzylaminopurine)，10～50g/L蔗糖和5～15g琼脂；培养基pH值为5.4～6.2；愈伤组织诱导条件为，黑暗条件下诱导，温度为15～30℃。2.愈伤组织细胞在同样组成的培养基中连续传代增值培养，经筛选建立细胞形态均一、生长稳定的万寿菊愈伤组织细胞系；连续传代增值培养具体是指，接种密度为50～200g/L；暗培养；温度为15～30℃；每2～4周继代培养一次。筛选具体是指，每次传代时选取收获细胞中30％～50％，形态疏松的、浅黄色愈伤组织细胞作为种子进行继代培养；筛选过程至少持续10代，直至所获得的细胞均为形态疏松的，颜色为浅黄色，生长稳定，建立愈伤组织细胞系。3.将步骤2筛选得到的万寿菊愈伤组织细胞系转入液体培养基中进行摇瓶悬浮培养，筛选并建立稳产、高产游离叶黄素的万寿菊悬浮细胞培养系。筛选具体是指，每次传代时选取收获细胞中30％～50％，分散性好、呈深绿色的细胞作为种子细胞进行继代培养，除去坚硬的细胞团以及呈褐色或者白色的细胞；筛选过程至少持续10代，直至所获得的细胞均为分散性好，形态为单细胞状态、非细胞团，颜色为深绿色，建立悬浮细胞培养系。悬浮细胞所用的培养基为MS(MurashigeandSkoog，1962)基础培养基，添加终浓度0.1～5mg/L1-萘乙酸(1-Naphthaleneaceticacid)，0.1～5mg/L激动素(kinetin)，10～50g/L蔗糖，pH值为5.4～6.2。悬浮细胞采用摇床旋转振荡培养，摇床转速为80～150rpm；温度为20～30℃；光照培养；每隔7～21天继代培养一次；细胞接种量为50～200g/L。悬浮细胞光照培养具体是指，光源组成为白光或者白光和蓝光的混合光，每天光照时间为4～24小时，总光照强度为2000～15000Lux。4.将稳产、高产游离叶黄素的万寿菊悬浮细胞接种到同样组成的新鲜液体培养基中扩大培养，进行游离叶黄素的生产；悬浮细胞扩大培养是指，按照步骤(3)的方法大规模培养悬浮细胞。5.培养细胞冷冻干燥后用有机溶剂浸提。有机溶剂浸提过程为：室温下，将冷冻干燥后的细胞粉碎成粉末状，然后用中等极性或者非极性有机溶剂提取，固液分离，收集提取液；固体再次用有机溶剂提取，共提取2～5次；合并提取液，过滤，减压蒸干；每次提取过程中，细胞粉末与有机溶剂质量体积比例1g：5～25ml；每次提取时，先超声提取10～60分钟，然后振荡或者静置提取30分钟～3小时；中等极性或者非极性有机溶剂包括甲醇、乙醇、丙酮、石油醚、乙醚、三氯甲烷、二氯甲烷或乙酸乙酯中的一种或二种以上。6.用超高效液相色谱测定游离叶黄素的产率。用色谱纯甲醇溶解步骤(5)获得的提取物，然后用超高效液相色谱测定游离叶黄素的产率。分析方法如下：色谱柱：WatersACQUITYBEHC18色谱柱(50mm×2.1mm，1.7μm)；流动相：A为乙腈-甲醇(90:10，v/v)，B为纯水；等度洗脱程序：0～2.5min，90％A；2.5～3.0min，90％A～100％A；3.0～6.0min，100％A；6.0～6.5min，100％A～90％A；6.5～9.5min，90％A。柱温：25℃；流速：0.4mL/min；进样体积：5μL；检测波长：448nm。有益效果目前商业化生产的叶黄素主要是从植物万寿菊花中提取，在原料来源和生产效率等方面受到一定的限制。1.本专利技术提供了一种生产叶黄素的新方法，为生物合成方法，不占用耕地，不受地理位置和季节的限制，整个生产过程可控，能够实现全年连续生产；2.万寿菊花中，叶黄素主要以叶黄素酯的形式存在。叶黄素酯必须经过皂化反应才能转化为游离叶黄素。而本专利技术中细胞产物直接为游离叶黄素，而非叶黄素酯，与从万寿菊花中提取相比，省去下游皂化反应步骤，缩短了分离的工艺流程，整个生产过程环境友好；3.本专利技术实现了万寿菊培养细胞的快速生长，叶黄素生产能力强，使得整个生产过程周期短、质量稳定可控；4.本专利技术中没有使用具有毒性的植物生长调节剂2,4-二氯苯氧基乙酸，以提高产品的安全性。具体实施方式实施例1：1.外植体诱导产生愈伤组织细胞：取新鲜的万寿菊花的花瓣，用自来水冲洗干净，然后用蒸馏水冲洗3次，用滤纸吸干。在生物安全柜内，将花瓣放入质量浓度75％乙醇中浸泡消毒30s。取出后用无菌蒸馏水冲洗3次，用无菌滤纸吸去花瓣表面水分，然后放置于无菌的培养皿上。在无菌条件下，将花瓣剪切成约0.5cm×0.5cm的小块，接种到愈伤组织诱导培养基上，每个培养基接入4～5个切块。愈伤组织诱导培养基为MS(MurashigeandSkoog，1962)基础培养基，添加0.5mg/L1-萘乙酸(1-Naphthale本文档来自技高网...

【技术保护点】
万寿菊细胞培养生产游离叶黄素的方法，其特征在于按照下述步骤进行：(1)将来自万寿菊植株的外植体清洗干净、灭菌，接种于愈伤组织诱导培养基上，诱导产生愈伤组织细胞；(2)愈伤组织细胞在同样组成的培养基中连续传代增值培养，经筛选建立细胞形态均一、生长稳定的万寿菊愈伤组织细胞系；(3)将步骤2筛选得到的万寿菊愈伤组织细胞系转入液体培养基中进行摇瓶悬浮培养，筛选并建立稳产、高产游离叶黄素的万寿菊悬浮细胞培养系；(4)将稳产、高产游离叶黄素的万寿菊悬浮细胞接种到同样组成的新鲜液体培养基中扩大培养，进行游离叶黄素的生产；(5)培养细胞冷冻干燥后用有机溶剂浸提，然后测定游离叶黄素的产率。

【技术特征摘要】
1.万寿菊细胞培养生产游离叶黄素的方法，其特征在于按照下述步骤进行：（1）将来自万寿菊植株的外植体清洗干净、灭菌，接种于愈伤组织诱导培养基上，诱导产生愈伤组织细胞；步骤（1）中所述的外植体为新鲜万寿菊花的花瓣；（2）愈伤组织细胞在同样组成的培养基中连续传代增殖培养，经筛选建立细胞形态均一、生长稳定的万寿菊愈伤组织细胞系；步骤（2）中所述的筛选具体是指，每次传代时选取收获细胞中30%～50%，形态疏松的、浅黄色愈伤组织细胞作为种子进行继代培养；筛选过程至少持续10代，直至所获得的细胞均为形态疏松的，颜色为浅黄色，生长稳定，建立愈伤组织细胞系；（3）将步骤（2）筛选得到的万寿菊愈伤组织细胞系转入液体培养基中进行摇瓶悬浮培养，筛选并建立稳产、高产游离叶黄素的万寿菊悬浮细胞培养系；步骤（3）中所述的筛选具体是指，每次传代时选取收获细胞中30%～50%，分散性好、呈深绿色的细胞作为种子细胞进行继代培养，除去坚硬的细胞团以及呈褐色或者白色的细胞；筛选过程至少持续10代，直至所获得的细胞均为分散性好，形态为单细胞状态、非细胞团，颜色为深绿色，建立悬浮细胞培养系；（4）将稳产、高产游离叶黄素的万寿菊悬浮细胞接种到同样组成的新鲜液体培养基中扩大培养，进行游离叶黄素的生产；（5）培养细胞冷冻干燥后用有机溶剂浸提，然后测定游离叶黄素的产率。2.权利要求1的方法，其特征在于：步骤（1）中所述的愈伤组织诱导培养基为MS（MurashigeandSkoog，1962）基础培养基，添加终浓度0.1～5mg/L1-萘乙酸（1-Naphthaleneaceticacid），0.1～5mg/L6-苄氨基嘌呤（6-Benzylaminopurine），10～50g/L蔗糖和5～15g琼脂；培养基pH值为5.4～6.2；愈伤组织诱导条件为，黑暗条件下诱导，温度为15～30℃。3.权利要求1的方法，其特征在于：步骤（2）中所述的连续传代增殖培养具体是指，接种密度为50～200g/L；暗培养；温度为15～30℃；每2～4周继代培养一次。4.权利要求1的方法，其特征在于：步骤（3）中所述的悬浮细胞所用的培养基为MS（Muras...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐晓辉，王莉洁，孙丹，何伟，
申请(专利权)人：何伟，徐晓辉，
类型：发明
国别省市：辽宁;21