FVIII的位点定向修饰制造技术

本发明专利技术涉及FVIII的位点定向修饰，还涉及因子VIII突变蛋白，其在非N‑末端胺的预定位点共价结合到一个或多个生物相容的聚合物，如聚乙二醇上。突变蛋白缀合物保留了FVIII前凝血剂活性，且具有提高的药物代谢动力学性质。

【技术实现步骤摘要】
本申请是申请日为2005年11月14日、申请号为201310125428.4、专利技术名称为“FVIII的位点定向修饰”的PCT申请的分案申请。与相关申请的交叉参考本申请要求享有2004年11月12日提交的美国专利申请系列号60/627,277的优先权利益，其在这里整体引作参考。
本专利技术涉及因子VIII(FVIII)突变蛋白，其允许在确定的位点偶联一个或多个生物相容的聚合物如聚乙二醇。另外，提供了用于治疗目的的相关的制剂、其剂量及施用方法。这些修饰的FVIII变体和相关的组合物和方法用于给遭受血友病A的个体提供具有减少的注射频率和减少的免疫原性应答的治疗选择。
技术介绍
血友病A是最常见的遗传性凝结障碍，估计的发病率为1/5000男性。它的原因是FVIII的缺乏或结构缺陷，所述FVIII是血液凝结的固有途径中的关键组分。目前血友病A的治疗包含静脉内注射人FVIII。已经重组地生产了人FVIII，作为约300kD的单链分子。它由结构域A1-A2-B-A3-C1-C2组成(Thompson，2003，Semin.Hematol.29，pp.11-22)。前体产物在高尔基体中被加工成200kD(重链)和80kD(轻链)的2条多肽链，这2条链通过金属离子结合到一起(Kaufman等，1988，J.Biol.Chem.263，p.6352；Andersson等，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.83，p.2979)。FVIII的B-结构域似乎是可有可无的，因为还已经显示B-结构域缺失的FVIII(BDD，90kDA1-A2重链+80kD轻链)可以有效地用作血友病A的替补疗法。B-结构域缺失的FVIII序列含有B-结构域的14个氨基酸以外的所有缺失。目前，通过根据需要静脉内施用FVIII来治疗血友病A患者，或者作为预防疗法每周施用几次。关于预防治疗，每周施用15-25IU/kg体重的因子VIII3次。患者总是需要它。因为它在人中的半衰期短，所以必须频繁地施用FVIII。尽管全长蛋白具有大于300kD的大尺寸，但FVIII具有仅约11小时的人中的半衰期(Ewenstein等，2004，Semin.Hematol.41，pp.1-16)。对频繁的静脉内注射的需要造成患者顺应性的巨大障碍。如果可以开发具有更长的半衰期且因而需要更低频率的施用的FVIII产物，则会更方便患者。另外，如果提高了半衰期，那么由于需要更低的剂量，可以降低治疗费用。现有疗法的另一个缺点是，约25-30％患者发展抑制FVIII活性的抗体(Saenko等，2002，Haemophilia8，pp.1-11)。抑制性抗体的主要表位定位于A2结构域中的残基484-508、A3结构域中的残基1811-1818和C2结构域。抗体发展阻止FVIII作为替补疗法的应用，迫使该组患者寻求使用高剂量重组因子VIIa的甚至更昂贵的治疗和免疫耐受疗法。下面的研究鉴别出了抑制性抗体的FVIII表位。在25份抑制性血浆样品的研究中，发现11份结合凝血酶产生的73kD轻链片段A3C1C2，4份结合A2结构域，且10份结合二者(Fulcher，C.等，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.2(22)，pp.7728-32)。在另一项研究中，重组A2多肽中和了8种来自患者的A2结构域抑制剂中的6种(Scandella，D.等，1993，Blood82(6)，pp.1767-75)。将9种来自患者的抑制剂中的6种的表位作图到A2残基379-538(Scandella，D.等，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.85(16)，pp.6152-6)。18种重链抑制剂的表位定位于相同的A2结构域N-末端18.3kD区域(Scandella，D.等，1989，Blood74(5)，pp.1618-26)。通过用同源猪序列替代人A2结构域残基387-604产生的有活性的重组杂种人/猪FVIII分子，对患者A2抑制剂是抗性的(Lubin，I.等，1994，J.Biol.Chem.269(12)，pp.8639-41)，且对与患者A2抑制剂竞争结合A2的鼠单克隆抗体mAB413IgG是抗性的(Scandella，D.等，1992，ThrombHaemost.67(6)，pp.665-71)。当实验表明mAB413IgG和4种患者抑制剂不抑制其中用猪序列替代A2结构域残基484-508的杂种人/猪FVIII时，该A2结构域表位进一步定位于A2结构域残基484-508(Healey，J.等，1995，J.Biol.Chem.270(24)，pp.14505-9)。该杂种FVIII还对筛选的23份患者血浆的至少一半是更高抗性的(Barrow，R.等，2000，Blood95(2)，pp.564-8)。丙氨酸扫描诱变鉴别的残基487对结合测试的所有5种患者抑制剂都是关键的，而残基484、487、489和492对于与mAB413IgG的相互作用都是重要的(Lubin，I.，J.Biol.Chem.272(48)，pp.30191-5)。在接受R484A/R489A/P492A突变体(而不是R484A/R489A突变体)的小鼠中的抑制性抗体效价，显著低于接受对照人BDDFVIII的小鼠(Parker，E.等，2004，Blood104(3)，pp.704-10)。总之，A2结构域的484-508区域似乎是FVIII活性的抑制剂的结合位点。除了发展对FVIII的免疫应答以外，常规疗法的另一个问题是，其需要频繁的给药，因为FVIII的体内半衰期短。已经研究了从循环清除FVIII的机理。从循环清除FVIII，已部分地归因于向低密度脂蛋白受体-相关蛋白(LRP)的特异性结合，所述LRP是具有广泛配体特异性的肝清除受体(Oldenburg等，2004，Haemophilia10Suppl4，pp.133-139)。最近，还表明低密度脂蛋白(LDL)受体在FVIII清除中起作用，如通过与LRP协同调节FVIII的血浆水平(Bovenschen等，2005，Blood106，pp.906-910)。两种相互作用都被结合细胞表面硫酸肝素蛋白聚糖(HSPG)所促进。当LRP被封闭时，可以使在小鼠中的血浆半衰期延长3.3倍，或者当LRP和细胞表面HSPG都被封闭时，可以延长5.5倍(Sarafanov等，2001，J.Biol.Chem.276，pp.11970-11979)。推测HSPG将FVIII集中在细胞表面上，并将其呈递给LRP。FVIII上的LRP结合位点已经被定位在A2残本文档来自技高网...

【技术保护点】
具有因子VIII前凝血剂活性的分离的多肽缀合物，由具有重链和轻链的功能因子VIII多肽构成，所述功能因子VIII多肽在重链共价附着到一个或多个生物相容的聚合物。

【技术特征摘要】
2004.11.12 US 60/6272771.具有因子VIII前凝血剂活性的分离的多肽缀合物，由具有重链和轻链的功能因子
VIII多肽构成，所述功能因子VIII多肽在重链共价附着到一个或多个生物相容的聚合物。
2.权利要求1的分离的多肽缀合物，其中所述生物相容的聚合物包含聚乙二醇。
3.权利要求2的分离的多肽缀合物，其中所述聚乙二醇包含甲氧基聚乙二醇。
4.权利要求3的分离的多肽缀合物，其中所述甲氧基聚乙二醇的大小范围为3kD-100
kD。
5.权利要求3的分离的多肽缀合物，其中所述甲氧基聚乙二醇的大小范围为5kD-64
kD。
6.权利要求3的分离的多肽缀合物，其中所述甲氧基聚乙二醇的大小范围为5kD-43
kD。
7.权利要求2的分离的多肽缀合物，其中所述功能因子VIII多肽是单PEG化或二PEG化
的。
8.权利要求1-7中任一项的分离的多肽缀合物，其中所述功能因子VIII多肽包含SEQ
IDNO:4的氨基酸序列或其等位基因变体。
9.权利要求1-7中任一项的分离的多肽缀合物，其中所述功能因子VIII多肽包含SEQ
IDNO:3的氨基酸序列。
10.药物组合物，用于治疗血友病A，所述组合物包含治疗有效量的权利要求1-7中任一
项的...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘小群，JE墨菲，梅柏松，JS斯特劳斯，H坦德拉，陈建敏，T巴内特，唐亮，汪德潜，
申请(专利权)人：拜尔健康护理有限责任公司，
类型：发明
国别省市：美国;US