核酸样品的制备方法及组合物技术

本文公开了用于在通用缓冲液中制备核酸文库(例如应用全基因组扩增)的组合物和方法，其中在步骤之间或步骤期间不需要核酸的纯化。应用少量起始核酸(例如，基因组DNA)并且所述步骤在单一容器中完成。可对所述核酸文库进行测序方法或滚环扩增。

【技术实现步骤摘要】
本申请是分案申请，其母案的中国申请号是201180068485.2，国际申请号是PCT/US2011/067374，申请日是2011年12月27日。
本申请要求于2010年12月27日提交的美国临时申请序号61/427,321的优先权，其全部通过引用结合到本文中。
专利

本专利技术提供了用于在通用缓冲液中制备核酸文库(例如，应用全基因组扩增)的组合物和方法，其中在步骤之间或步骤期间不需要核酸的纯化。在某些实施方案中，应用少量起始核酸(例如，基因组DNA)并且所述步骤在单一容器中完成。在一些实施方案中，可对所述核酸文库进行测序方法或滚环扩增。
背景在例如基因诊断、癌症研究或法医学等许多研究领域中，基因组DNA的不足对可在样品上进行的基因试验的类型和数量而言可是严重的限制性因素。设计以克服该问题的一个方法是全基因组扩增。目标是以非特异性的方式扩增有限的DNA样品以产生与原始样品无区别但具有更高DNA浓度的新样品。典型的全基因组扩增技术的目的是在遵守原始序列表征的同时将样品扩增至微克水平。
首个全基因组扩增方法描述于1992年，并且是基于聚合酶链式反应的原理。Zhang及同事(Zhang,L.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1992,89:5847-5851；通过引用结合到本文中)开发了引物延伸PCR技术(PEP)以及Telenius和合作者(Telenius等,Genomics.1992,13(3):718-25；通过引用结合到本文中)设计了简并寡核苷酸引物PCR法(DOP-PCR)。
PEP涉及高数目的PCR循环，其通常利用Taq聚合酶和在低的严格性温度下退火的15个碱基的随机引物。虽然已以不同的方式改善PEP方案，但其仍导致不完全的基因组覆盖度，未能扩增某些序列例如重复序列。未能启动并扩增包含重复序列的区域可导致全基因组的不完全表征，因为横穿基因组长度的稳定的引物覆盖度提供了基因组的最佳表征。该方法对非常少的样品(如单个细胞)也有有限的效率。此外，Taq聚合酶的使用意味着最大的产物长度为约3kb。
DOP-PCR为通常用Taq聚合酶和半简并寡核苷酸(例如CGACTCGAGNNNNNNATGTGG(SEQIDNO:12)，例如其中N=A、T、C或G)的方法，所述寡核苷酸在低退火温度下结合人基因组内约一百万个位点。在第一循环后用较高退火温度进行大量循环，其仅允许在第一步骤中标记的片段扩增。这导致全基因组的不完全表征。与PEP相似，DOP-PCR产生平均400-500bp、最大长度3kb的片段，尽管已报道产生长达10kb的片段。另一方面，如对PEP所指出，基因组DNA的低输入(少于1ng)降低了保真度和基因组覆盖度(Kittler等,Anal.Biochem.2002,300(2),237-44)。
多重置换扩增(MDA，亦称为链置换扩增；SDA)是基于随机六聚体对变性DNA的退火而不基于PCR的等温方法，随后在恒定温度下进行链置换合成(Blanco等,1989,J.Biol.Chem.264:8935-40，通过引用结合到本文中)。其已适用于少量的基因组DNA样品，导致具有有限的序列表征偏好的高分子量DNA的合成(Lizardi等,NatureGenetics1998,19,225-232；Dean等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2002,99,5261-5266；这两者通过引用结合到本文中)。随着DNA通过链置换合成，逐渐增加的许多启动事件发生，形成超分支DNA结构的网络。所述反应可通过Phi29DNA聚合酶或通过大片段的BstDNA聚合酶催化。Phi29DNA聚合酶具有比Taq聚合酶导致的错误率低至1/100的校对活性。
所需要的是在步骤之间或步骤期间不需要核酸纯化，和/或可在单一容器中完成的全基因组扩增方法。
专利技术简述本专利技术提供了用于在通用缓冲液中制备核酸文库(例如DNA文库)(例如应用全基因组扩增，例如MDA)的组合物和方法，其中在步骤之间或步骤期间不需要核酸纯化。在某些实施方案中，应用少量起始核酸(例如，基因组DNA)(例如，皮克级或纳克级)并且所述步骤在单一容器中完成。在一些实施方案中，可对所述核酸文库进行测序方法或滚环扩增。
在一些实施方案中，本专利技术提供了在通用缓冲液中制备核酸文库的方法，所述方法包括：a)将核酸样品(例如，基因组DNA)加入通用缓冲液中，其中所述通用缓冲液包含dNTP和引物；b)将所述通用缓冲液与多种基本上纯化的酶接触，其中所述酶有聚合酶活性、激酶活性和磷酸酶活性，并且其中所述接触是在使得产生扩增的核酸的条件下进行；c)处理所述通用缓冲液(例如通过机械、化学或酶的方法)使得产生剪切的扩增核酸；d)处理所述通用缓冲液以灭活聚合酶的活性；和e)将所述通用缓冲液与连接酶和核酸接头在使得产生连接接头的核酸文库的条件下接触；其中以上步骤在通用缓冲液中完成而无需在步骤中的一些或全部之间或期间进行核酸的纯化。
在具体的实施方案中，通过全基因组扩增(例如，MDA)产生扩增的核酸。在另外的实施方案中，所述步骤(例如步骤a)–e))中的一些或全部在单一容器中进行。在其它实施方案中，所述方法还包括处理包含所述连接接头的核酸文库的通用缓冲液使得蛋白和dNTP从所述通用缓冲液中移除。在具体的实施方案中，所述处理包括将所述通用缓冲液与蛋白酶和磷酸酶接触，或柱纯化所述通用缓冲液。在其它实施方案中，所述接头包含发夹结构引物，并且其中所述连接接头的核酸文库包含环形模板。
在另外的实施方案中，所述方法还包括用能够消化存在的任何非环化核酸的至少一种核酸外切酶处理包含所述环形模板的通用缓冲液。在一些实施方案中，所述方法还包括加热包含所述核酸外切酶的通用缓冲液使得所述核酸外切酶失活。在另外的实施方案中，所述接头包含3’和/或5’的封闭基团，并且其中所述连接接头的文库包含末端封闭的模板。在其他实施方案中，所述方法还包括用能够消化存在的任何非末端封闭核酸的至少一种核酸外切酶处理包含所述末端封闭模板的通用缓冲液。在另外的实施方案中，所述方法还包括加热包含所述核酸外切酶的通用缓冲液使得所述核酸外切酶失活。
在一些实施方案中，所述通用缓冲液还包含乳化剂。在某些实施方案中，所述乳化剂为聚山梨醇酯(例如，Tween20、Tween40、Tween60或Tween80)。在其它实施方案中，所述通用缓冲液还包含三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)。在另外的实施方案中，所述通用缓冲液还包含二价金属阳离子。在另外的实施方案中，所述通用缓冲液还包含无机盐。在另外的实施方案中，所述无机盐为硫酸铵。
在另外的实施方案中，所述通用缓冲液还包含聚腺苷酸。在另外的实施方案中，所述通用缓冲液还包含α-连接的二糖。在一些实施方案中，所述α-连接的二糖包含海藻糖。在另外的实施方案中，所述通用缓冲液还包含还原剂。在具体的实施方案中，所述还原剂还包含二硫苏糖醇(DTT)。在某些实施方案中，所述通用缓冲液还包含白蛋白或白蛋白样蛋白。
在一些实施方案中，所述方法还包括，在步骤c)后，孵育所述通用缓冲液使得在已剪切的扩增核酸中产生磷酸化的平末端(和/或加A尾的末端)。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种在通用缓冲液中制备核酸文库的方法，所述方法包括：a)将核酸样品与通用缓冲液混合，其中所述通用缓冲液包含dNTP和引物；b)将所述通用缓冲液与多种基本上纯化的酶接触，其中所述酶有聚合酶活性、激酶活性和磷酸酶活性，并且其中所述接触在使得产生扩增的核酸的条件下进行；c)处理所述通用缓冲液使得产生剪切的扩增核酸；d)处理所述通用缓冲液以灭活所述聚合酶的活性；和e)将所述通用缓冲液与连接酶和核酸接头在使得产生连接接头的核酸文库的条件下接触；其中以上步骤在所述通用缓冲液中完成而无需核酸纯化。

【技术特征摘要】
2010.12.27 US 61/4273211.一种在通用缓冲液中制备核酸文库的方法，所述方法包括：
a)将核酸样品与通用缓冲液混合，其中所述通用缓冲液包含dNTP和引物；
b)将所述通用缓冲液与多种基本上纯化的酶接触，其中所述酶有聚合酶活性、激酶活性和磷酸酶活性，并且其中所述接触在使得产生扩增的核酸的条件下进行；
c)处理所述通用缓冲液使得产生剪切的扩增核酸；
d)处理所述通用缓冲液以灭活所述聚合酶的活性；和
e)将所述通用缓冲液与连接酶和核酸接头在使得产生连接接头的核酸文库的条件下接触；
其中以上步骤在所述通用缓冲液中完成而无需核酸纯化。
2.权利要求1的方法，其中所述核酸样品包含基因组DNA，并且其中所述扩增的核酸通过全基因组扩增来产生。
3.权利要求1的方法，其中所述步骤a)-e)在单一容器中进行。
4.权利要求1的方法，还包括处理含有所述连接接头的核酸文库的所述通用缓冲液使得蛋白和dNTP从所述通用缓冲液中去除。
5.权利要求1的方法，其中所述接头包含发夹结构的引物，并且其中所述连接接头的核酸文库包含环形模板。
6.权利要求5的方法，还包括用能够消化存在的任何非环化核酸的至少一种核酸外切酶处理含有所述环形模板的所述通用缓冲液。
7.权利要求6的方法，还包括加热含有所述核酸外切酶的所述通用缓冲液使得所述核酸外切酶失活。
8.权利要求1的方法，其中所述通用缓冲液还包含乳化剂。
9.权利要求1的方法，其中所述通...

【专利技术属性】
技术研发人员：MW埃舒，J皮库里，S莫特利，
申请(专利权)人：艾比斯生物科学公司，
类型：发明
国别省市：美国;US