本发明专利技术公开了一种抗人平足蛋白血小板聚集区的单克隆抗体及其应用，分别由保藏编号为CCTCC NO:C201613和CCTCC NO:C2015185的杂交瘤细胞系所分泌，所述单克隆抗体命名为SZ‑163和SZ‑168，为IgG1亚类抗体，与还原性的PDPN特异性结合，与NCI‑H226细胞裂解液结合在分子量36kDa出现结合带，与重组人PDPN‑Fc结合在分子量67kDa出现结合带。一株能够阻断肿瘤细胞与血小板的结合所诱导的血小板的活化聚集，另一株抗PDPN单克隆抗体能够与第一株功能抑制性抗体结合于PDPN的不同抗原表位。所述抗体可用于制备抗肿瘤转移药物所述或者建立双抗体夹心法测定人血浆可溶性PDPN的含量。
【技术实现步骤摘要】
抗人平足蛋白血小板聚集区的单克隆抗体及其应用
本专利技术涉及抗人平足蛋白(Podoplanin,PDPN)刺激血小板聚集结构域(PLateletAGgregation-stimulating，PLAG)功能区的单克隆抗体SZ-163和SZ-168及其制备方法；本专利技术进一步涉及所制备功能性抗体在制备抑制肿瘤生长与转移的药物中的应用；本专利技术涉及单克隆抗体在建立双抗体夹心ELISA检测人血浆可溶性PDPN中的应用。
技术介绍
由于环境，饮食，生活习惯与工作压力，以及遗传等因素，肿瘤的发生率与死亡率一直居高不下，肿瘤已成为严重危害人类健康的常见病，多发病。肿瘤转移是肿瘤患者死亡的一个主要原因。尽管肿瘤转移的机制长期得到临床医师和科学工作者的重视，迄今对于肿瘤转移的分子机制仍然不太清楚。因此对于如何预防控制肿瘤的转移仍然缺乏有效的手段，预防和抑制肿瘤转移将在相当长的时期内是肿瘤防治中的重点,热点和难点。近几年来，越来越多的证据显示血小板在肿瘤转移中起着重要的作用。血小板在肿瘤转移中的机制可能有以下几种：1.人们发现很多肿瘤细胞直接诱导血小板聚集(释之为：Tumorcell-inducedplateletaggregation，TIPA)。活化的血小板释放很多细胞因子，包括血小板衍生血管生长因子等。这些细胞因子能够促进肿瘤细胞的转移和生长，有助于血管的再生；2.肿瘤细胞导致血小板活化通过释放ADP合成血栓烷A2(TXA2)等最后导致整合素糖蛋白Ⅱb/Ⅲa(GPⅡb/Ⅲa)的活化。肿瘤患者活化性的血小板升高，更加促进了上述过程的发生发展；3.活化的血小板直接粘附在肿瘤细胞表面，从而帮助肿瘤细胞逃避机体的免疫攻击,同时也有助于肿瘤细胞的着床、粘附，从而有利于肿瘤细胞的转移。近年来在肿瘤的治疗中发现，抗血小板聚集药物应用于肿瘤患者的治疗，虽然伴随着出血的风险，但是可以抑制肿瘤的发生发展和转移，因此对抗血小板聚集药物在肿瘤发生发展中的作用机制的研究也许可以为肿瘤的发生，生长，转移与治疗提供新的研究思路与方法。现有研究表明：在血小板与肿瘤细胞相互作用中起关键作用的分子之一是平足蛋白(Podoplanin,PDPN)，PDPN是I型唾液黏蛋白，最初发现是在淋巴管内皮，也是淋巴管内皮的特异性标志物，在正常组织如肾，肺泡I型细胞等表面表达。PDPN的结构有三部分组成，胞外区是由162个氨基酸组成，含有大量的丝氨酸、苏氨酸残基，其中的EDxxVTPG片段是刺激血小板聚集的结构域(platelet–aggregation-stimulating，PLAG)，位于氨基酸序列的29-54个氨基酸之间，这种序列在物种之间高度保守，PLAG区有三个重复序列组成，主要起作用的是PLAG3，其Thr52作为O-聚糖唾液酸化的位点，跨膜区为单链跨膜，胞内区是由9个氨基酸组成,具有蛋白激酶A/C磷酸化位点；血小板表面表达的CLEC-2是PDPN的内源性受体，与PDPN结合依赖于O-聚糖唾液酸的存在中心，不依赖血浆成分，结合后可以直接诱导血小板的活化聚集，与其他位点结合弱且不诱导血小板聚集，诱导血小板活化聚集有一个延迟的过程。最近发现很多肿瘤细胞(肺肿瘤，胃肿瘤，肠肿瘤，鳞状上皮细胞癌、恶性间皮瘤、Kaposi肉瘤、血管肉瘤、睾丸精原细胞瘤和脑肿瘤等)也表达PDPN，且把PDPN作为新的肿瘤标志物。肿瘤组织表面表达PDPN上调能引起血小板活化，这可能是血小板促进肿瘤的转移与生长的基础。因此，抗PDPN的抗体可能阻止肿瘤的转移与生长，为肿瘤药物的研发提供新的方向。抗PDPN的PLAG区功能抑制性单抗通过抑制PDPN与CLEC-2的结合，来阻止血小板的活化聚集，这不是生理状态下血小板活化聚集的主要途径，所以抗PDPN抗体不仅能抑制肿瘤的转移，而且不会出现抗血小板聚集药物引起的出血的风险，有很大的应用价值。因此，研制和开发阻断PDPN的PLAG区与CLEC-2之间相互作用的单克隆抗体，不仅能阻止肿瘤细胞与血小板的结合，从而阻止肿瘤的转移，为肿瘤的治疗提供新的方向与方法；研制的针对PDPN的不同抗原表位的单克隆抗体用于双抗体夹心ELISA方法，在检测癌症等患者的血浆可溶性PDPN水平提供一个可行的方法。血浆可溶性PDPN水平测定可作为一种新的肿瘤标志物作为肿瘤发生和转移的诊断和预后监控和判别。
技术实现思路
本专利技术目的是提供抗人平足蛋白血小板聚集区的单克隆抗体及其应用，提供的二株抗PDPN的功能性单克隆抗体中，一株能够阻断肿瘤细胞与血小板的结合所诱导的血小板的活化聚集，另一株抗PDPN单克隆抗体能够与第一株功能抑制性抗体结合于PDPN的不同抗原表位。本专利技术的另一目的是提供能产生上述特异性抗PDPN的PLAG区的单克隆抗体的杂交瘤细胞系。本专利技术的再一目的是提供上述特异性抗PDPN的PLAG区的单克隆抗体在制备抗肿瘤转移药物中的应用及在双抗体夹心ELISA方法制备中的应用。细胞株的保藏信息为：保藏地址：湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心，保藏单位：武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏日期：2016年1月20日，杂交瘤细胞株SZ-163,保藏编号：CCTCCNO:C201613；杂交瘤细胞株SZ-168,保藏编号：CCTCCNO:C2015185。为达到上述目的，本专利技术具体技术方案是，两种杂交瘤细胞株，其制备方法包括以下步骤：(1)为了增加免疫原性，我们使用人工合成人PDPN的PLAG区的22肽的多肽片段(DTETTGLEGGVAMPGAEDDVVC)与钥孔戚血蓝蛋白(KLH)偶联作为免疫原(参见实施例1)，以常规方法免疫Balb/c小鼠；(2)获取融合细胞生长克隆：从免疫合格小鼠无菌取其脾细胞作为抗原致敏的B细胞，按常规方法，将B细胞与骨髓瘤细胞SP2/0株融合，然后利用常规的融合细胞HAT筛选方法进行筛选，进而获取融合细胞生长克隆；(3)应用ELISA法、流式细胞术和Western印迹法等免疫学技术筛选和鉴定后，挑选出两株具有高抗体分泌水平的杂交瘤细胞株SZ-163和SZ-168。(参见实施例2)；上述技术方案中，使用人工合成22肽-KLH片段作为免疫原，常规三次免疫接种8周龄雌性Balb/c小鼠(每次间隔4周)；用酶联免疫吸附法(ELISA)检测被免疫动物血清中抗PDPN抗体的存在和浓度；免疫完成后，选择产生足够高浓度抗血清的小鼠，分离动物脾脏并制备脾细胞悬液；按照已知的杂交瘤技术(参见：KǒhlerandMilstein，Nature，215：495-497，1975；Kǒhleretal，ImmunologyToday，4：72-76，1983)将所得到的小鼠脾细胞与骨髓瘤相融合，制备可持续传代并分泌抗PDPN单克隆抗体的杂交瘤细胞系。两种抗PDPN的单克隆抗体，所述单克隆抗体属于IgG1亚类抗体，由上述杂交瘤细胞系产生，制备所述单克隆抗体的方法有两种：(1)在杂交瘤培养液中接种上述杂交瘤细胞，培养后培养液中分离纯化得所需的特异性抗PDPN的单克隆抗体；(2)在动物腹腔内接种上述杂交瘤细胞，动物腹水液中分离和纯化得所需的特异性抗PDPN的单克隆抗体。可使用间接酶联免疫测定IgG浓度，并可进一步用免疫印迹法(Western-Blot)和流式细胞术(FC本文档来自技高网...
【技术保护点】
抗PLAG的杂交瘤细胞株，其保藏编号分别为CCTCC NO: C201613和CCTCC NO: C2015185。
【技术特征摘要】
1.抗PLAG的杂交瘤细胞株，其保藏编号分别为CCTCCNO:C201613和CCTCCNO:C2015185。2.抗PLAG的单克隆抗体，分别由保藏编号为CCTCCNO:C201613和CCTCCNO:C2015185的杂交瘤细胞系所分泌，所述单克隆抗体命名为SZ-163和SZ-168。3.根据权利要求2所述的抗PLAG的单克隆抗体，其为IgG1亚类抗体。4.根据权利要求2所述的抗PLAG的单克隆抗体，其可与多种人癌细胞特异性结合。5.根据权利要求4所述的抗PLAG的单克隆抗体，其与还原性的PDPN特异性结合，与NCI-H226细胞裂解液结合在分子量36kDa出现结合带，与重组人PDPN-Fc结合在分子量67kDa出现结合带。6.权利要求2所述抗PLAG的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，在杂...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵益明，夏利军，赵星鹏，傅建新，阮长耿，沈飞，
申请(专利权)人：苏州大学附属第一医院，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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