一种基因Hdiv‑SARP19‑I1及其重组蛋白的抗菌应用，涉及基因工程。一种Hdiv‑SARP19‑I1基因的蛋白编码区，其核酸序列如序列表SEQ ID No.1所示；Hdiv‑SARP19‑I1基因的序列，其核酸序列如序列表SEQ ID No.2所示；一种Hdiv‑SARP19‑I1蛋白序列，其氨基酸序列如序列表SEQ ID No.3所示；一种由毕赤酵母分泌表达的Hdiv‑SARP19‑I1重组蛋白的氨基酸序列，如序列表SEQ ID No.4所示。基因Hdiv‑SARP19‑I1的重组蛋白可在制备拮抗肺炎克雷伯氏菌的蛋白类药物和拮抗肺炎克雷伯氏菌的杀菌剂中应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物技术中的基因工程领域，尤其是涉及一种基因Hdiv-SARP19-I1及其重组蛋白的抗菌应用。
技术介绍
Hdiv-SARP19-I1基因是从杂色鲍幼体转录组序列数据中筛选获得的[1]，其编码区长度为453bp。因其编码的蛋白与玉黍螺(Littorinalittorea)的SARP19蛋白[2]具有较高相似性，因此命名为Hdiv-SARP19-I1基因[3]。在杂色鲍幼体发育过程中有一个附着变态阶段，在此阶段适应于浮游的幼体组织消失，适应于底栖的稚体组织形成，此间形成的组织器官包括了消化系统[4]。前期实验证明，Hdiv-SARP19-I1基因在刚发育形成的消化腺中有明显的高水平表达。SARP19蛋白或其同源蛋白的功能至今未见报道。该基因的时空表达模式和进化模式[2,3]表明其功能很可能与防御相关。酵母作为单细胞真核生物，因具有比较完备的真核基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰能力，在真核蛋白的表达方面具有很强的优势。毕赤酵母表达系统是上世纪80年代初期发展起来的一种新型外源蛋白表达系统。以甲醇营养型-毕赤酵母为代表的第二代酵母表达系统，是近年来被公认的最有效的外源蛋白表达系统之一，已有多种外源蛋白在该宿主系统中获得了成功表达。作为生产外源蛋白的重要宿主菌，依靠其各种不同功能的表达载体，已经得到广泛的应用。表达的蛋白质包括酶、膜蛋白、抗原、抗体和调节蛋白等[5,6]。克雷伯氏菌属(Klebsiella)为革兰氏阴性杆菌，主要有肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)、臭鼻克雷伯氏菌(K.ozaenae)和鼻硬结克雷伯氏菌(K.rhinoscleromatis)。克雷伯氏菌为人体本身存在菌属，当受到感染或免疫力下降时，则容易发病。其中肺炎克雷伯氏菌对人致病性较强，是重要的条件致病菌和医源性感染菌之一，可引起肺炎、脑膜炎、呼吸道感染、泌尿系感染、腹膜炎、腹泻及败血症等。肺炎克雷伯氏菌容易产生耐药性演化为超级细菌，2000年以来，已发现多株对西力欣、复达欣等16种高档抗生素的耐药性高达52％-100％的肺炎克雷伯氏菌菌株。医学界对耐药性的肺炎克雷伯氏菌治疗给予极高关注[7,8,9]。参考文献：1.HuangZX,ChenZS,KeCH,ZhaoJ,YouWW,ZhangJ,DongWT,ChenJ(2012).PyrosequencingofHaliotisdiversicolortranscriptomes:insightsintoearlydevelopmentalmolluscangeneexpression.PLoSOne7(12),e51279.2.LaradeK,StoreyKB(2004).Anoxia-inducedtranscriptionalupregulationofsarp-19:cloningandcharacterizationofanovelEF-handcontaininggeneexpressedinhepatopancreasofLittorinalittorea.BiochemCellBiol＝BiochimetBiolCell82(2):285–2933.HeTF,ChenJ,ZhangJ,KeCH,andYouWW(2014).SARP19andvdg3genefamiliesarefunctionallyrelatedduringabalonemetamorphosis.DevelopmentGenesandEvolution224,197-207.4.JacksonDJ,EllemorN,DegnanBM(2005).Correlatinggeneexpressionwithlarvalcompetence,andtheeffectofageandparentageonmetamorphosisinthetropicalabaloneHaliotisasinina.MarineBiology147(3):681-697.5.CereghinoJL,CreggJM(2000).HeterologousproteinexpressioninthemethylotrophicyeastPichiapastoris.FemsMicrobiologyReviews24(1):45–66.6.CreggJM,VedvickTSandRaschkeWC(1993).RecentadvancesintheexpressionofforeigngenesinPichiapastoris.BioTechnology11:905-910.7.KhanSNandKhanAU(2016).BreakingtheSpell:CombatingMultidrugResistant'Superbugs'.FrontMicrobiol7:174.8.DeRosaFG,CorcioneS,CavalloR,DiPerriG,andBassetti,M(2015).CriticalissuesforKlebsiellapneumoniaeKPC-carbapenemaseproducingK.pneumoniaeinfections:acriticalagenda.Futuremicrobiology10(2):283-294.9.CurelloJ,andMacDougallC(2014).BeyondSusceptibleandResistant,PartII:TreatmentofInfectionsDuetoGram-NegativeOrganismsProducingExtended-Spectrumbeta-Lactamases.JPediatrPharmacolTher19(3):156-164.
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种基因Hdiv-SARP19-I1及其重组蛋白的抗菌应用。本专利技术提供一种Hdiv-SARP19-I1基因的蛋白编码区，其核酸序列如序列表SEQIDNo.1所示，其中碱基1～45位编码信号肽，46～453编码成熟的Hdiv-SARP19-I1蛋白，454～456位为终止密码子；本专利技术提供一种优化了密码子并能在毕赤酵母中高效表达的Hdiv-SARP19-I1基因的序列，其核酸序列如序列表SEQIDNo.2所示，其中碱基1～42位引入了限制性内切酶EcoRI的酶切位点、组氨酸纯化标签和肠激酶标签，43～450位为Hdiv-SARP19-I1蛋白去除信号肽后的编码区，451～453为终止密码子，454～461为限制性内切酶NotI的酶切位点；本专利技术提供一种Hdiv-S本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种Hdiv‑SARP19‑I1基因的蛋白编码区，其特征在于其核酸序列如序列表SEQ ID No.1所示，其中碱基1～45位编码信号肽，46～453编码成熟的Hdiv‑SARP19‑I1蛋白，454～456位为终止密码子。
【技术特征摘要】
1.一种Hdiv-SARP19-I1基因的蛋白编码区，其特征在于其核酸序列如序列表SEQID
No.1所示，其中碱基1～45位编码信号肽，46～453编码成熟的Hdiv-SARP19-I1蛋白，454～
456位为终止密码子。
2.一种Hdiv-SARP19-I1基因的序列，其特征在于其核酸序列如序列表SEQIDNo.2所
示，其中碱基1～42位引入了限制性内切酶EcoRI的酶切位点、组氨酸纯化标签和肠激酶标
签，43～450位为Hdiv-SARP19-I1蛋白去除信号肽后的编码区，451～453为终止密码子，
454～461为限制性内切酶NotI的酶切位点。
3.一种Hdiv-SARP19-I1蛋白序列，其特征在于其氨基酸序列如序列表SEQIDNo.3所
示。
4.一种由毕赤酵母分泌表达的Hdiv-SARP19-I1重组蛋白的氨基酸序列，其特征在于如
序列表SEQIDNo.4所示，其中1～20位点为融合部分，包含组氨酸纯化标签和肠激酶标
签，21～156位点为去除信号肽的Hdiv-SARP19-I1蛋白。
5.Hdiv-SARP19-I1重组蛋白的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)表达载体的构建：将合成的目的基因和载体pPIC9.0K用限制性内切酶EcoRI和
NotI进行双酶切，酶切后产物进行琼脂糖电泳并用胶回收试剂盒回收DNA片段并连接；将
连接产物加入感受态大肠杆菌TOP10中，热激转化，在LB液体培养基培养1h，将菌液涂布
在含Zeocin的LB固体培养基平板上，37℃培养过夜；从长好的平板上随机挑取若干生长
状况良好的单克隆菌落，接种在含Zeocin的LB液体培养基培养过夜，用质粒提取试剂盒
提取重组质粒，用限制性内切酶EcoRI和NotI对重组质粒进行双酶切，电泳验证基因片段
正确插入，该重组质粒...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈军，柯才焕，林泽，丁少雄，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：福建;35
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