一种α-地中海贫血基因检测试剂盒制造技术

技术编号:13347201 阅读:66 留言:0更新日期:2016-07-14 22:53
本发明专利技术提供一种可同时检测6种缺失型α‑地中海贫血基因(‑α3.7、‑α4.2、‑‑SEA、‑‑THAI、‑‑FIL和‑α27.6)和6种非缺失型α‑地中海贫血基因(αCSα、αQSα、αWSα、α13α、α43‐44α和α49α)的试剂盒,包括DNA芯片、PCR反应液I和PCR反应液II,所述DNA芯片包括基底和固定于所述基底上的探针。本发明专利技术的有益效果在于:采用PCR‑反向点杂交的检测原理,根据各基因型的突变或缺失位点,设计相应的扩增引物和探针,将探针固定在DNA芯片上,通过特异性引物扩增出来的PCR产物,与固定在DNA芯片上的探针进行杂交、信号显色盒判读来进行地贫的诊断。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
,涉及一种在临床样本中一次实验诊断12种α-地中海贫血基因(包括6种缺失型α-地中海贫血基因和6种非缺失型α-地中海贫血基因)的试剂盒。
技术介绍
地中海贫血(简称“地贫”)是由于珠蛋白基因发生缺陷,致使珠蛋白链合成减少或不能合成,使形成血红蛋白的珠蛋白链比例失衡,而导致的一种可遗传的溶血性血液病。主要包括两种类型:α-地贫和β-地贫。但α-地贫的人群携带率远高于β-地贫。α-地贫(包括缺失型α-地贫和非缺失型α-地贫)是世界上最常见的单基因遗传病之一,中国南方的广西、广东、云南、海南、香港等省市及其周边地区是本病的高发地区。α珠蛋白基因位于16号染色体上,每条16号染色体有2个α珠蛋白基因(简称“α-基因”)。α-地贫是由于α-基因发生突变导致肽链失衡而造成的。若是染色体上的1个α-基因发生了缺失或缺陷,α链的合成只受到了部分抑制,则称为α+地贫;若是染色体上2个α-基因都发生了缺失或缺陷称为α0地贫。只有1个α-基因发生异常,即α+地贫杂合状态时,一般没有明显的临床症状,表现型为静止型;当2个α-基因发生异常,即α+地贫纯合子或者α0杂合子状态时,仍有相当数量的α-链合成,症状轻微,表现型为标准型;当3个α-基因发生异常,即α0和α+地贫的杂合子状态时,患者仅能合成少量的α-链,症状为中度溶血性贫血,表现型为血红蛋白H病(HbH病);当4个α-基因发生异常,即α0地贫纯合子状态,无法生成α-链。正常情况下胎儿的血红蛋白主要成分为HbF,由于缺乏α-链。多余的γ-链聚合形成四聚体,即HbBart’s。HbBart’s具有很高的氧亲和性,无法解决胎儿宫内供养的生理机能,继而引发胎儿水肿症,导致胎儿在宫内受累或分娩后半小时内死亡的妊娠结局。中国常见的缺失型α-地贫基因型主要为-α3.7、-α4.2和--SEA,这三种缺失型在个体中的不同组合,可表现为静止型、标准型、血红蛋白H病和HbBart’s胎儿水肿综合症这四种表现型。随着α-地贫机制的进一步阐明,一些新的基因缺失型相继被发现,如--THAI(泰国型α-地贫)、--FIL(菲律宾型α-地贫)、-α27.6等。--THAI缺失片段比--SEA缺失的片段还要长,缺失片段包括α1基因和α2基因,在临床上可以形成中重型α地中海贫血,即泰国型缺失的HbH病和泰国型缺失的巴氏水肿胎。而--THAI的血液学特征与--SEA一致,表现为小细胞低色素性贫血,MCV水平降低,MCH量降低等,但由于--THAI属于少见型α-地贫,不在常规的筛查范围内常常易造成漏检或误检,继而导致泰国型HbH病或泰国型巴氏水肿胎儿的出生。--FIL与--THAI同样属于大片段缺失,其缺失的片段也包括α1基因和α2基因,在临床上可能会导致中重型地贫儿的出生。-α27.6缺失了一个α基因,在临床上可能引起HbH病。在中国南方非缺失型α-地贫的发病率也较高,常见基因型为αCSα、αQSα和αWSα,除此之外,中国人群中还报道了一些较为少见的突变类型如α13α、α43-44α、α49α。非缺失型α-地贫是导致临床α-地贫漏诊的主要原因之一。在正常情况下,α2较α1基因的功能强,表达量也较α1基因大;当发生基因突变时,α2基因的突变一般会比α1基因突变降低基因产物的作用更大。当α2基因发生非缺失型突变时,α-链的产量比α2基因发生缺失时明显减少。因此,有些非缺失型α-地贫的纯合子可以表现为HbH病。对于地贫尚无理想的治疗方法,而地贫携带者又多无症状而不易察觉,因此降低其发生率的有效方法是对高发地区的婚孕人群广泛开展地贫基因筛查,若检出高危人群即患者或者携带者则应进行产前诊断,产前诊断可预防重型和中间型地贫患儿出生,对于优生优育和提高国民身体素质有着重要的意义。目前常见的地贫基因检测方法有Southern印迹杂交-限制性酶谱分析法、跨越断裂点PCR(GAP-PCR)法、PCR-寡核苷酸探针(ASO)和PCR-反向点杂交(PCR-RDB)法等;生产厂家主要有亚能生物技术(深圳)有限公司、深圳益生堂生物企业有限公司、中山大学达安基因股份有限公司和潮州凯普生物化学有限公司等。国内临床常用的方法为PCR-反向点杂交法、GAP-PCR法。上述地贫基因检测方法中,Southern印迹杂交-限制性酶谱分析法曾是α地贫基因诊断的主要方法,但由于操作繁琐,所需时间较长而难以推广;跨越断裂点PCR(GAP-PCR)法通过一次PCR确定缺失突变形成的各种α地贫基因类型,已广泛应用于产前基因诊断。但只能应用于缺失型α-地贫基因检测产品,对于非缺失型α-地贫无法检测;PCR-寡核苷酸探针(ASO)法可快速简便地检测已知突变的地贫基因,具有很高的灵敏性和准确性,但一次杂交只能检测一种突变,而且还需要同位素探针,难以推广应用;多重连接依赖式探针扩增技术(MLPA)是2002年发展起来的一种针对待检DNA序列进行定性和半定量分析的技术,该方法能对缺失基因型进行检测,具有高效、特异的特点,在同一反应管内检测多达45个不同核酸序列拷贝数变化,;常用于α、β地贫大片段缺失基因型的检测。但其检测成本高,操作繁琐,耗时较长,检测流程长达16小时,且需要特殊的仪器设备,一般只用于研究使用,不便于分子筛查方法的推广应用;PCR-反向点杂交(PCR-ReverseDotBlot,PCR-RDB)法具有灵敏度高、特异性好和准确性高等优点,目前已广泛应用于非缺失型α-地贫的临床基因诊断;采用基因检测方法的地贫检测产品有亚能生物的α-地中海贫血基因检测试剂盒和非缺失型α-地中海贫血基因检测试剂盒、深圳益生堂的缺失型α-地中海贫血基因诊断试剂盒和非缺失型α-地中海贫血基因检测试剂盒、达安基因的α-地中海贫血基因检测试剂盒和非缺失型α-地中海贫血基因检测试剂盒、潮州凯普的α-地中海贫血基因检测试剂盒(PCR+导流杂交法)。国内主要地贫产品相关信息见表1:表1--THAI与--FIL均为大片段缺失,缺失的片段比--SEA还要长,在临床上可形成中重型α-地中海贫血,即HbH病或巴氏水肿胎。由于--THAI--FIL和的血液学特征与--SEA一致,因而可能会造成误诊和漏诊,继而导致中重型地中海贫血患儿的出生。-α27.6亦属于大片段缺失,其缺失了1个α基因,在临床上有可能导致HbH病。非缺失型α-地贫在中国南方的发生率也较高,非缺失型α-地贫是导致临床α-地贫漏诊的主要原因。非缺失型α-地贫的突变大多位于功能较强的α2基因,故非缺失型HbH病人的临床表现要比本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种α‑地中海贫血基因检测试剂盒,其特征在于:包括DNA芯片、PCR反应液I和PCR反应液II,所述DNA芯片包括基底和固定于所述基底上的探针,所述探针包括:非缺失型α‑地中海贫血基因所对应的正常对照探针,其碱基序列如SEQ ID NO:1‑6;用于检测非缺失型α‑地中海贫血基因的探针,其碱基序列如SEQ ID NO:8‑13;用于检测缺失型α‑地中海贫血基因的探针,其碱基序列如SEQ ID NO:15‑20;内参探针,其碱基序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:14;所述PCR反应液I包括:扩增缺失型α‑地中海贫血基因的引物,其碱基序列如下:引物3.7F,SEQ ID NO:23;引物3.7R,SEQ ID NO:24;引物4.2F,SEQ ID NO:25;引物4.2R,SEQ ID NO:26;引物SEAF,SEQ ID NO:27;引物SEAR,SEQ ID NO:28;引物THAIF,SEQ ID NO:29;引物THAIR,SEQ ID NO:30;引物FILF,SEQ ID NO:31;引物FILR,SEQ ID NO:32;引物27.6F,SEQ ID NO:33;引物27.6R,SEQ ID NO:34;内参引物,其碱基序列如下:引物IC1F,SEQ ID NO:35;引物IC1R,SEQ ID NO:36;所述PCR反应液II包括:扩增非缺失型α‑地中海贫血基因的引物,其碱基序列如下:引物ATF,SEQ ID NO:21;引物ATR,SEQ ID NO:22;内参引物,其碱基序列如下:引物IC2F,SEQ ID NO:37;引物IC2R,SEQ ID NO:38。...

【技术特征摘要】
1.一种α-地中海贫血基因检测试剂盒,其特征在于:包括DNA芯片、PCR反应液I和PCR反
应液II,所述DNA芯片包括基底和固定于所述基底上的探针,所述探针包括:
非缺失型α-地中海贫血基因所对应的正常对照探针,其碱基序列如SEQIDNO:1-6;
用于检测非缺失型α-地中海贫血基因的探针,其碱基序列如SEQIDNO:8-13;
用于检测缺失型α-地中海贫血基因的探针,其碱基序列如SEQIDNO:15-20;
内参探针,其碱基序列如SEQIDNO:7和SEQIDNO:14;
所述PCR反应液I包括:
扩增缺失型α-地中海贫血基因的引物,其碱基序列如下:
引物3.7F,SEQIDNO:23;
引物3.7R,SEQIDNO:24;
引物4.2F,SEQIDNO:25;
引物4.2R,SEQIDNO:26;
引物SEAF,SEQIDNO:27;
引物SEAR,SEQIDNO:28;
引物THAIF,SEQIDNO:29;
引物THAIR,SEQIDNO:30;
引物FILF,SEQIDNO:31;
引物FILR,SEQIDNO:32;
引物27.6F,SEQIDNO:33;
引物27.6R,SEQIDNO:34;
内参引物,其碱基序列如下:
引物IC1F,SEQIDNO:35;
引物IC1R,SEQIDNO:36;
所述PCR反应液II包括:
扩增非缺失型α-地中海贫血基因的引物,其碱基序列如下:
引物ATF,SEQIDNO:21;
引物ATR,SEQIDNO:22;
内参引物,其碱基序列如下:
引物IC2F,SEQIDNO:37;
引物IC2R,SEQIDNO:38。
2.根据权利要求1所述的α-地中海贫血基因检测试剂盒,其特征在于,所述基底为尼龙
膜。
3.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员:刘福平郑瑜刘晶晶李印淑未纪涛
申请(专利权)人:亚能生物技术深圳有限公司
类型:发明
国别省市:广东;44

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