本发明专利技术涉及一种高致病性猪繁殖与呼吸综合征标记疫苗及其制备方法。本疫苗生产毒种为构建的JXA1‑RM株，不仅保持了JXA1‑R株安全性和免疫原性，且该毒株稳定性好，细胞生产病毒含量高；疫苗免疫猪后，不产生针对美洲株PRRS病毒M蛋白线性表位肽氨基酸序列的多肽序列抗体，能用于区分免疫和自然感染动物；针对该毒株的鉴别诊断方法，可以诊断田间毒株和疫苗毒株产生的抗体，结合常规ELISA检测方法，能用于区分免疫该疫苗和自然感染田的动物，有利于高致病性猪蓝耳病的净化。
【技术实现步骤摘要】
一种高致病性猪繁殖与呼吸综合征标记疫苗及其血清学鉴别方法
本专利技术涉及一种高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗及其制备方法，并可通过血清学鉴别诊断方法实现免疫与自然感染的区分，属于兽用生物制品领域。
技术介绍
高致病性猪繁殖与呼吸综合征(俗称高致病性猪蓝耳病)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV)变异株引起猪的一种急性、高度致死性接触性传染病。根据OIE制定的《陆生动物诊断试验和疫苗手册》2008版本规定，该病被列为法定上报的动物疫病之一，在我国被列为“一类动物疫病”，是威胁我国养猪业的重要传染病之一。2006年高致病性猪蓝耳病暴发以来，研究人员通过不同方法研制出了高致病性猪繁殖与呼吸综合征疫苗毒株JXA1-R、HuN4-F112株、TJM-F92株和GDr180株。这些毒株可以抵抗经典蓝耳病与高致病性蓝耳病强毒毒株攻击，在我国高致病性猪蓝耳病的防控中发挥了重要的作用，然而，近年来高致病性猪蓝耳病成散发趋势，依然导致巨大的经济损失，原有疫苗不能区分免疫和自然感染，目前仍在使用疫苗预防高致病性猪蓝耳病的国家或地区，想通过净化手段来达到控制消灭高致病性猪蓝耳病的目的，但是没有相应的方法能够区分免疫和自然感染，使得预防的效果一直不理想，现亟待开发一种能区分免疫和自然感染(DIVA，DiscriminationofInfectedfromVaccinatedAnimals)的疫苗。申请人将临床分离毒株猪繁殖与呼吸综合征病毒NVDC-JXA1(保藏编号：CGMCCNo.1964)在MARC-145细胞系上进行人工连续培养，制备了对猪致病力显著下降的JXA-R株，并用该毒株研制了活疫苗(专利公开号：CN101307305)。本专利技术以高致病性猪繁殖与呼吸综合征JXA1-R株为基础，构建其全长感染性克隆，并突变JXA1-R毒株ORF6上的第159，160，164位的三个氨基酸，经拯救获得高致病性猪繁殖与呼吸综合征标记疫苗毒株JXA1-RM，该毒株不仅同时保持了高致病性猪繁殖与呼吸综合征疫苗株JXA1-R安全性好，免疫原性优良等特点，而且ORF6上三个氨基酸的突变使JXA1-RM毒株免疫动物后与野毒株产生抗体差异，因此可以作为DIVA疫苗用于高致病性猪蓝耳病的预防与控制。
技术实现思路
本专利技术的目的主要是通过构建了高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒JXA1-R株的全长克隆，并通过反向遗传操作技术，突变该毒株ORF6上的第159位精氨酸(Arg)为赖氨基(Lys)，160位赖氨基酸(Lys)为精氨酸(Arg)，164位谷氨酰胺(Gln)为精氨酸(Arg)，成功拯救并繁殖了病毒，该病毒毒株命名为PorcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusJXA1-RM株。通过实验证实该标记疫苗毒株不仅对高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒感染具有较好的免疫保护效果，而且不能诱导机体产生针对突变前该表位序列(SEQIDNO.15)的特异性抗体，能通过针对该肽段(SEQIDNO.15)的抗体来区分免疫与自然感染，从而在血清学上实现对标记疫苗的鉴别诊断。JXA1-RM毒株可作为能区分免疫和自然感染(DIVA)的疫苗毒株。本专利技术所建立的ELISA鉴别诊断方法，通过优化抗原包被条件和反应条件，能够通过血清学鉴别诊断免疫了JXA1-RM疫苗株的动物和自然感染动物。本专利技术技术方案本专利技术是通过以下技术方案来实现的：1.一种高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗，其特征在于该疫苗主要成分是PorcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusJXA1-RM株活病毒，该病毒毒株已于2015年12月08日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCCNo.10041。2.如权利要求1所述一种高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗，其特征在于用此疫苗免疫猪体后，不产生针对美洲株PRRS病毒M蛋白线性表位肽氨基酸序列(SEQIDNo.15)的多肽序列抗体，能用于区分免疫和自然感染动物。3.如权利要求1所述一种高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗，其特征在于其中的猪繁殖与呼吸综合征病毒JXA1-RM株是按以下方法构建获得的：(1)以高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒JXA1-R株(CGMCCNo.2467)为模板，分6段扩增出全长；(2)依次将片段连入pBluscriptSK+载体中，构建成JXA1-R株的全长cDNA克隆；(3)以高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒JXA1-R株全长感染性克隆为载体pJXA1-R，利用引物引入突变序列，构建成高致病性猪繁殖与呼吸综合征标记疫苗毒株JXA1-RM的全长cDNA克隆；经拯救后获得一株病毒，命名为PorcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusJXA1-RM株，该病毒毒株保藏编号为：CGMCCNo.10041；(4)测定病毒的繁殖及遗传稳定性。4.一种高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗的制备方法，其特征在于：该方法是以PorcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusJXA1-RM作为疫苗生产毒种，接入生长良好的MARC-145细胞，按常规细胞活疫苗的制造方法制成高致病性猪繁殖与呼吸综合征标记疫苗。5.如权利要求2所述的一种高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗，其特征在于其中所述疫苗免疫后能区分疫苗免疫和自然感染的方法是以美洲株猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋白线性表位肽序列(SEQIDNO.15)为抗原，包被ELISA反应板，优化血清作用条件及二抗显色条件，建立的合成肽抗体的ELISA检测试剂盒。具体实施方式高致病性猪繁殖与呼吸综合征标记疫苗毒株是通过以下技术方案实现的：一、高致病性猪繁殖与呼吸综合征标记疫苗毒株的构建1.高致病性猪繁殖与呼吸综合征疫苗毒株JXA1-R株全长克隆的构建：(1)RNA提取，反转录，PCR扩增：取猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗JXA1-R(该毒株于2008年4月29日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCCNo.2467)生产毒种，提取总RNA，反转录，根据发表于Genebank(登录号：FJ548853.1)的猪繁殖与呼吸综合征病毒序列设计6对引物(SEQIDNo.1-12)，将其基因组分6段扩增，分别命名为A、B、C、D、E、F，全部克隆至pEASY-Blunt载体(全式金公司)，选取阳性克隆，提取质粒，分别命名为pA，pB，pC，pD，pE，pF。上游引物AF：5’-CCCCCCTCGAGATTTAGGTGACACTATAGGATGACGTATAGGTGTTGGC-3’本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种高致病性猪繁殖与呼吸综合征标记疫苗，其特征在于该疫苗主要成分是Porcine reproductive and respiratory syndrome virus(猪繁殖与呼吸综合征病毒)JXA1‑RM株活病毒，该病毒毒株已于2015年12月10日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.10041。
【技术特征摘要】
1.一种高致病性猪繁殖与呼吸综合征标记疫苗，其特征在于该疫苗包括Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(猪繁殖与呼吸综合征病毒)JXA1-RM株活病毒，该病毒毒株已于2015年12月08日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCCNo.10041。
2.如权利要...
【专利技术属性】
技术研发人员：翟新验，韩焘，辛盛鹏，周智，张硕，原霖，吴佳俊，王静，徐琦，訾占超，汪葆玥，刘颖昳，倪建强，李硕，李晓霞，马英，亢文华，王传彬，
申请(专利权)人：中国动物疫病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：北京;11
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