基于多种核酸适体的多蛋白同时在线富集检测方法技术

本发明专利技术涉及一种基于多种核酸适体配基的多种蛋白同时富集的在线检测方法。在该方法中，首先多种核酸适体修饰的整体材料在色谱系统上对蛋白混合物进行同时在线富集，然后利用不同蛋白与相应核酸适体结合能力的差异进行分别洗脱，进而达到分别检测的目的。本发明专利技术借助了核酸适体高特异性和高选择性的特点，专一地富集相对应的蛋白。在色谱系统上，利用梯度洗脱使不同的蛋白先后通过检测器产生色谱信号，从而提高了在线检测的通量。另外，通过质谱的分析，蛋白质上的翻译后修饰仍然能够得到很好的保留，在蛋白质组学的研究中具有较好的实用性。

【技术实现步骤摘要】
基于多种核酸适体的多蛋白同时在线富集检测方法
本专利技术涉及多种蛋白的同时富集和检测，具体地说是将二种及以上的核酸适体修饰于亲水毛细管整体柱上并用于多种目标蛋白的高效高选择性富集和在线灵敏检测。
技术介绍
核酸适体(Aptamer，又称适配体，适配子)是单链寡核苷酸(ssDNAorssRNA)，具有高亲和性、高特异性地结合靶标的能力。核酸适体能够与靶标通过范德华力、氢键、π-π堆积、疏水作用等分子间作用力形成较强的结合力，特异地识别靶标。核酸适体可以通过配体指数富集系统进化技术(SystematicEvolutionofLigandsbyEXponentialenrichment，SELEX)筛选获得，筛选得到核酸适体具有亲和性好、选择性高、性质稳定、易于化学修饰等诸多优点，同时可以根据核苷酸序列进行大量的人工合成。目前已报道的核酸适体靶标包括金属离子、小分子、蛋白质、细胞(Nature1993,364,550-553；TrendsinAnalyticalChemistry2012,41,46-57)，应用领域广阔，有望成为一种“人工抗体”。传统上，核酸适体都用于单一靶标的一对一检测(AnalyticalChemistry2008,80,7586–7593)。但对于多目标蛋白质体系的分析检测而言，传统的一对一模式已不能满足多蛋白同时检测的需求。因此有必要发展基于多种核酸适体的多蛋白同时在线富集的检测方法。为此，我们将二种及以上的核酸适体修饰在毛细管亲水整体柱上。毛细管整体柱相对于开管柱和填充柱，具有反压小，通透性好，易于实现在线等优势，其应用非常广泛。通过亲水改性，再修饰上核酸适体，能够减少非特异性吸附，提高目标蛋白的检测回收率。修饰在亲水整体柱上的核酸适体能够在色谱系统上在线同时富集相应的蛋白，利用不同蛋白与相对应的核酸适体结合能力之间的差异分别洗脱，达到同时富集并分别检测的目的。
技术实现思路
将多种目标蛋白各自所对应的核酸适体混合物，通过共价键结合在毛细管亲水整体柱上，在色谱系统中同时在线富集多种目标蛋白，采用梯度洗脱模式使不同蛋白先后洗脱并经过检测器进行信号采集。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：将二种或以上核酸适体溶解于核酸适体缓冲液中，将上述溶液持续通入毛细管亲水整体柱，将核酸适体修饰于毛细管亲水整体柱上，将有核酸适体修饰的整体柱作为液相色谱柱接入液相色谱系统中；通过液相色谱对多种蛋白混合物溶液进行分离和检测。毛细管亲水整体柱可以是硅胶基质整体柱、聚合物整体柱、有机-无机杂化整体柱中的任意一种，具体为GMA-PEGDA，MAA-MBA，BMA-EGDA、HEMA-DEGDA，LMA-PEGDA，AAm-MBA，VTMS-TMOS，VTMS-TEOS-MAA中的任意一种，内径10-500μm，长度5-20cm；亲水整体柱材料上键合有羧基、氨基、醛基、环氧基、巯基、叠氮基团、炔基、纳米金、纳米银或纳米镉中的任意一种功能基团；核酸适体通过与毛细管亲水整体柱材料的上述功能基团共价结合，修饰于毛细管亲水整体柱上。所述核酸适体为针对组蛋白、凝血酶、Nucleolin、HIV-1surfaceglycoprotein(gp120)、TranscriptionfactorHMGA1b、Vasopressin、Ghrelin、Angiogenin、Angiopoietin-2、Cytokines、IgE、Ricin、VEGF、PDGF-B、细胞色素C的核酸适体或其它蛋白筛选出来核酸适体中的任意二种或以上；核酸适体缓冲溶液中每种核酸适体终浓度为1-25μM；任意两种核酸适体之间的摩尔浓度比为0.2-5.0:1；核酸适体缓冲溶液通入毛细管亲水整体柱的持续时间为0.25-6h，温度为4-37℃。多种蛋白混合物溶液中蛋白的总浓度为0.005-0.5μg/μL；多种蛋白混合物溶解在核酸适体缓冲液中；核酸适体缓冲液为水、PBS、Tris-HCl缓冲液或磷酸盐缓冲液(以磷酸一氢根和磷酸二氢根为缓冲离子对，可适当添加其它离子)中的任意一种，pH范围为7.2-8.5，当核酸适体缓冲液为PBS、Tris-HCl缓冲液或磷酸盐缓冲液中的任意一种时，缓冲液中各种溶质的总浓度范围为10mM-180mM；以核酸适体缓冲液作为上样缓冲液，液相色谱上样量为1-20μL。液相色谱上样流速为0.5-5μL/min；所用洗脱相为30-100mM的EDTA、0.2-0.5M的甘氨酸-盐酸(pH＝2.2-3.5)、质量浓度为10-25％的二氧六环、质量浓度为40-70％的乙二醇、质量浓度为75-90％的甲醇、质量浓度为25-40％的乙腈、0.5-2.0M的NaClO4或2.0-4.0M的NaCl水溶液中的任意一种；线性梯度洗脱的梯度时间为10-30min，在梯度时间内，洗脱相比例占洗脱相与上样缓冲液总体积的百分比由0％变化到100％。通过色谱工作站上观测到组分出峰时开始收集；当峰信号强度接近基线时停止收集；采用紫外检测器进行检测，检测波长为214-280nm。经液相色谱分离收集的蛋白组分可用蛋白酶酶解生成肽段，采用液相色谱-质谱联用技术，对肽段进行分离后，进行样品分析。利用高能碰撞解离(Higher-energycollisionaldissociation，HCD)模式对肽段进行二级碎裂。采集数据利用蛋白质组数据库搜索引擎进行肽段的信息分析。本专利技术提供的方法可以应用于二种或以上蛋白同时富集和在线检测。本专利技术具有如下优点：1.本专利技术采用两种以上的核酸适体，能够在线同时富集两种以上的蛋白，提高了对目标蛋白的选择性识别能力。2.本专利技术采用2MNaClO4、2.5MNaCl等洗脱能力强的溶液为洗脱相，能够先后洗脱下富集到的蛋白并得到检测，提高了实验通量。3.本专利技术采用毛细管亲水整体材料，非特异吸附小，且材料刚性，机械强度好，可耐受0-40MPa的压力范围，适用pH范围宽(1-14)。4.通过质谱的分析，富集到的蛋白上的翻译后修饰仍然能够得到很好的保留，在蛋白质组学的研究中具有较好的实用性。附图说明图1为同时修饰有凝血酶核酸适体和组蛋白核酸适体的毛细管亲水整体柱对凝血酶(T)、组蛋白提取物(H)以及凝血酶与组蛋白提取物的混合物(T+H)分别进行检测的液相色谱叠加图图2为验证同时修饰有凝血酶核酸适体和组蛋白核酸适体的毛细管亲水整体柱对凝血酶(T)保留情况的SDS-PAGE图图3为同时修饰有凝血酶核酸适体和组蛋白核酸适体的毛细管亲水整体柱对组蛋白提取物(H)中组蛋白H4的GGK(Ac)GLGK(Ac)GGAK(Ac)R肽段的质谱鉴定图。具体实施方式下面通过实施例对本专利技术提供的方法进行详述，但不以任何形式限制本专利技术。实施例1同时修饰有凝血酶核酸适体和组蛋白核酸适体的毛细管亲水整体柱按如下流程制备：将巯基修饰的凝血酶核酸适体和组蛋白核酸适体(巯基基团与核酸适体之间由间隔臂即6个亚甲基连接，购自宝生物工程(大连)有限公司)等摩尔比(1：1)溶解在核酸适体缓冲液PBS中，其中每种核酸适体的终浓度均为25μM，连续通入内径200μm，长10cm的纳米金掺杂的毛细管亲水整体柱，室温下反应4h。纳米金掺杂的GMA-PEGDA毛细管亲水整体柱的制备方法：GMA-P本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于多种核酸适体的多蛋白同时在线富集检测方法，其特征在于：将二种或以上核酸适体溶解于核酸适体缓冲液中，将上述溶液持续通入毛细管亲水整体柱，将核酸适体修饰于毛细管亲水整体柱上，将有核酸适体修饰的整体柱作为液相色谱柱接入液相色谱系统中；通过液相色谱对蛋白混合物溶液进行分离和检测。

【技术特征摘要】
1.一种基于两种核酸适体的两种蛋白同时在线富集检测方法，其特征在于：将两种核酸适体溶解于核酸适体缓冲液中，将该溶解了两种核酸适体缓冲液持续通入毛细管亲水整体柱，将核酸适体修饰于毛细管亲水整体柱上，将有核酸适体修饰的整体柱作为液相色谱柱接入液相色谱系统中；通过液相色谱对蛋白混合物溶液进行分离和检测；液相色谱上样流速为0.5-5μL/min；所用上样缓冲液为PBS、Tris-HCl缓冲液或磷酸盐缓冲液，pH范围为7.2-8.5；所用洗脱相为30-100mM的EDTA、pH＝2.2-3.5的0.2-0.5M的甘氨酸-盐酸、质量浓度为10-25％的二氧六环、质量浓度为40-70％的乙二醇、质量浓度为75-90％的甲醇、质量浓度为25-40％的乙腈、0.5-2.0M的NaClO4或2.0-4.0M的NaCl中的任意一种水溶液，线性梯度洗脱的梯度时间为10-30min，在梯度时间内，洗脱相比例占洗脱相与上样缓冲液总体积的百分比由0％变化到100％；采用紫外检测器进行检测，检测波长为214-280nm；经液相色谱分离收集的蛋白组分用蛋白酶酶解生成肽段，采用液相色谱-质谱联...

【专利技术属性】
技术研发人员：张丽华，陈远波，邓楠，吴慈，杨开广，梁振，张玉奎，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁;21