用于治疗骨性关节炎的脂肪间充质干细胞制剂的制备方法技术

本发明专利技术涉及骨性关节炎治疗领域，尤其是一种用于治疗骨性关节炎的脂肪间充质干细胞制剂的制备方法，第一步，微囊化脂肪间充质干细胞的制备；第二步，制备动物来源的软骨细胞与滑膜细胞；第三步，对脂肪间充质干细胞的炎症性诱导；第四步，脂肪间充质干细胞的处理。本发明专利技术所得到的用于治疗骨性关节炎的脂肪间充质干细胞制剂的制备方法，在体外利用骨性关节炎来源的细胞与脂肪间充质干细胞共培养，并发明专利技术了一种新的体外共培养体系，使得脂肪间充质干细胞在体外就可以获得针对骨性关节炎的治疗特性，移植体内后可显著提升对骨性关节炎的治疗效果。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及骨性关节炎治疗领域，尤其是一种用于治疗骨性关节炎的脂肪间充质干细胞制剂的制备方法。
技术介绍
骨性关节炎是一种以关节软骨退行性变和继发性骨质增生为主要病症的慢性关节疾病，好发于负重较大的膝关节、髋关节、脊柱及手指等部位，严重影响患者的肢体功能和日常生活，病情严重者会出现关节疼痛，活动受限，甚至可能造成关节畸形，甚至残疾，是影响人类健康最常见的关节疾患之一。骨关节炎发病率非常高，是影响女性健康的第4位疾病，是影响男性健康的第8位疾病。据统计45岁以下人群骨关节炎患病率约为5%～10%；但是55～65岁，发病率为40%～60%；而75岁以上人群为80%。估计全球骨关节炎患者总人数高达3.5亿以上。在亚洲平均每6个人中就有1人患有骨关节炎。骨关节炎作为一种典型的老年性疾病，其发病机制至今仍不是非常明确，像骨内压增高、细胞因子、基质金属蛋白酶、自由基、免疫反应等因素都会造成骨关节炎。现有治疗骨关节炎方式主要有物理治疗、药物治疗、手术治疗三种方式。物理治疗主要指适量运动。适当强度的运动能增强身体功能，从而减缓骨关节炎的恶化。物理疗法还包括利用声、光、电设备进行超声疗法、电磁疗法、激光疗法、电刺激疗法等。这些疗法或多或少能降低关节处II型胶原酶的分泌，刺激细胞代谢，减轻疼痛等作用。但是物理治疗效果非常有限，只能作为一种辅助的治疗措施。药物治疗是目前骨性关节炎主要的治疗手段，药物治疗又可以分为（1）非甾体类药物，主要包括有阿司匹林、吲哚美辛、布洛芬等，这类药物作用是镇痛，但没有消炎的能力，不能阻止病程的进展。而新一代的非甾体类药物如塞来昔布、罗非昔布等，即具有消炎的作用，也具有止痛的作用。（2）营养关节的药物，该类药物主要是营养保护软骨结构，代表性的药物有硫酸软骨素、硫酸氨基葡萄糖、透明质酸等。（3）抗氧化药物，主要作用是抵御消除细胞代谢过程中所产生的活性氧和自由基，保护软骨组织中的透明质酸、蛋白多糖、胶原等细胞外基质的结构不被破坏。（4）抗炎药物，主要是指糖皮质激素，直接注射该药物对于缓解剧烈疼痛具有显著作用，但是该药物会加速软骨病损，因此不能频繁应用。而当患者症状非常严重，经过药物治疗无效，严重影响日常生活的患者，可以考虑进行手术治疗。目前手术治疗方法繁多，每种方法适应症各不相同，关节清理术、胫骨结节前移术只能用于病情比较轻微的病理，对于关节病变重而广泛的患者，人工全膝关节置换术是最终的选择。相对于以上三种治疗方案，干细胞治疗是最近逐渐兴起的一种新的骨性关节炎治疗方式，尤其是间充质类干细胞。间充质干细胞是一类具有自我更新与多向分化能力的细胞，可以分化为骨、软骨、脂肪等多种组织。间充质干细胞还具有免疫原性低，调节机体免疫反应，细胞因子分泌能力强等特点，具有治疗骨性关节炎的潜力。脂肪间充质干细胞是间充质干细胞中的重要类型，脂肪间充质干细胞不仅具备间充质干细胞所有的生物特性，还具有（1）取材容易，因为脂肪组织来源广泛，只需对患者进行局部麻醉即可开展吸脂术；（2）脂肪中干细胞数量较骨髓中更多；（3）脂肪间充质干细胞体外增殖速率较高。目前已经有大量的临床前研究证实，脂肪间充质干细胞可以治疗骨性关节炎，并且无论是关节局部注射，还是关节腔注射，都取得了良好的效果，脂肪间充质干细胞不仅延缓了关节炎的进一步发展，促进新生透明软骨的形成，并且没有毒副作用。因此脂肪间充质干细胞治疗骨性关节炎的临床实验也已经在不同国家陆续开展，并都取得了积极的临床治疗效果。尽管间充质干细胞治疗关节软骨取得了很大的进展，间充质干细胞的治疗效果还不稳定，疗效也需要进一步提高。间充质干细胞对不同的组织环境具有不同的响应性，当间充质干细胞在骨性关节炎环境中，会调整自身细胞的状态，分泌适于改善关节炎的细胞因子或相关营养分子，但是当间充质干细胞突然移植到关节内会突然面对强烈的炎症与自由基环境，细胞活性与功能受到了影响，从而减弱了骨性关节炎的治疗效果。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决上述技术的不足而提供一种用于治疗骨性关节炎的脂肪间充质干细胞制剂的制备方法，其在体外利用骨性关节炎来源的细胞与脂肪间充质干细胞共培养，使得脂肪间充质干细胞在体外就可以获得针对骨性关节炎的治疗特性，移植体内后可显著提升对骨性关节炎的治疗效果。为了达到上述目的，本专利技术所设计的用于治疗骨性关节炎的脂肪间充质干细胞制剂的制备方法，第一步，微囊化脂肪间充质干细胞的制备：收集培养结束的3代-10代的脂肪间充质干细胞，将脂肪间充质干细胞充分、均匀的混悬在海藻酸钠、羧甲基壳聚糖、聚乙二醇-4000三种物质混合配制的溶液中，其中三种物质的浓度分别为1%～3%、1%～3%、4～10%，其基础溶剂为生理盐水，脂肪间充质干细胞悬浮在混合液中的终浓度控制在1×105～1×106，将含有脂肪间充质干细胞的混合液加入到微量注射器中，然后注射到含40～100mmol/L的CaCl2的DMEM培养液中，控制出液的液珠球径不大于0.5mm，将含脂肪间充质干细胞的液珠在含CaCl2的液体中静置30秒～1分钟形成凝胶微球，然后将凝胶微球转到DMEM培养基中待用；本专利技术首先制备了一种含脂肪间充质干细胞的凝胶微球，该凝胶微球主要由海藻酸钠、羧甲基壳聚糖、聚乙二醇-4000三种物质制备而成。海藻酸钠是阴离子型化合物，在含Ca2+的溶液中会形成凝胶，但是海藻酸钠凝胶在电解质溶液中稳定性非常差。羧甲基壳聚糖是即含阳离子也含阴离子的多糖，羧甲基壳聚糖与海藻酸钠在一起能显著提升海藻酸钠凝胶在电解质溶液中的稳定性。同时聚乙二醇能改善海藻酸钠凝胶微球的抗降解性能，避免凝胶微球在与脂肪间充质干细胞，以及后面涉及的滑膜细胞、软骨细胞等共培养时结构不被细胞分泌的酶或化合物所破坏。同时聚乙二醇-4000的也能提高海藻酸钠凝胶微球的通透性，使凝胶微球更容易与外界进行物质的交换。第二步，制备动物来源的软骨细胞与滑膜细胞：准备6～12月大的哺乳动物，利用生理盐水配制木瓜蛋白酶与胶原酶的混合酶液，木瓜蛋白酶的浓度为2%～6%，其中胶原酶采用II型胶原酶,II型胶原酶的浓度为1%～3%,将混合酶液每隔2～3天注射0.2～0.5mL到每只哺乳动物的髋关节中，一共注射3～6次，注射完成后的半个月到2个月后，打开髋关节，可见关节软骨有明显的变性时取出滑膜组织与软骨组织；本步骤的主要目的是为了制备哺乳动物的骨性关节炎，酶注射法是一种常用的骨性关节炎动物模型的制备方法，木瓜蛋白酶是一种水解酶，II型胶原酶可以直接作用软骨基质，当两种酶共同作用关节软骨后，可致关节软骨表面糜烂、腐蚀、细胞坏死，并导致软骨下骨质硬化以及骨囊肿与骨赘形成，并伴有滑膜炎、关节增厚，软骨细胞排列混乱。与骨性关节炎的临床模型极为相似。第三步，对脂肪间充质干细胞的炎症性诱导：将滑膜组织与软骨组织取出后，利用无菌的平衡液清洗多遍，将滑膜组织和软骨组织用止血钳与剪刀剪切成约为1mm×1mm×1mm的体积较小的组织块，将组织块放入培养瓶中，倒入少量含10%胎牛血清的DMEM培养液，培养液略微覆盖组织块表面，在37℃、5%CO2浓度、95%湿度条件下培养本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于治疗骨性关节炎的脂肪间充质干细胞制剂的制备方法，其特征是：第一步，微囊化脂肪间充质干细胞的制备：收集培养结束的3代‑10代的脂肪间充质干细胞，将脂肪间充质干细胞充分、均匀的混悬在海藻酸钠、羧甲基壳聚糖、聚乙二醇‑4000三种物质混合配制的溶液中，其中三种物质的浓度分别为1%～3%、1%～3%、4～10%，其基础溶剂为生理盐水，脂肪间充质干细胞悬浮在混合液中的终浓度控制在1×105～1×106，将含有脂肪间充质干细胞的混合液加入到微量注射器中，然后注射到含40～100mmol/L的CaCl2的DMEM培养液中，控制出液的液珠球径不大于0.5mm，将含脂肪间充质干细胞的液珠在含CaCl2的液体中静置30秒～1分钟形成凝胶微球，然后将凝胶微球转到DMEM培养基中待用；第二步，制备动物来源的软骨细胞与滑膜细胞：准备6～12月大的哺乳动物，利用生理盐水配制木瓜蛋白酶与胶原酶的混合酶液，木瓜蛋白酶的浓度为2%～6%，其中胶原酶采用II型胶原酶, II型胶原酶的浓度为1%～3%,将混合酶液每隔2～3天注射0.2～0.5mL到每只哺乳动物的髋关节中，一共注射3～6次，注射完成后的半个月到2个月后，打开髋关节，可见关节软骨有明显的变性时取出滑膜组织与软骨组织；第三步，对脂肪间充质干细胞的炎症性诱导：将滑膜组织与软骨组织取出后，利用无菌的平衡液清洗多遍，将滑膜组织和软骨组织剪切成体积较为1mm×1mm×1mm的小组织块，将组织块放入培养瓶中，倒入少量含10%胎牛血清的DMEM培养液，培养液略微覆盖组织块表面，在37℃、5%CO2浓度、95%湿度条件下培养4～6小时，然后加入足量的α～MEM培养液，培养3～15天后，更换DMEM培养液并倒去未贴壁的细胞与组织块，同时将含间充质干细胞的凝胶微球加入到上述培养瓶中，与滑膜组织、软骨组织进行共培养，培养3～7天后，利用100～300目的筛网滤得含脂肪间充质干细胞的凝胶微球，利用无菌平衡溶液清洗凝胶微球5～10遍，其中共培养体系的培养液成分为：基础溶剂为DMEM，含10%胎牛血清，1～3ng/mL的白介素‑1，1～3ng/mL的白介素‑17，1～3ng/mL的肿瘤坏死因子；第四步，脂肪间充质干细胞的处理：将培养结束后的脂肪间充质干细胞的凝胶微球加入含0.05%～0.1%乙二胺四乙酸二钠、1%～5%柠檬酸三钠的DMEM培养液中，在37℃条件下温育1～3个小时，直至凝胶微球结构崩解，采用轻柔的方法将脂肪间充质干细胞充分的打散在液体中，直至不可见凝胶结构，然后用100～300目的筛网进行过滤，收集脂肪间充质干细胞的混悬液，然后离心收集脂肪间充质干细胞，利用无菌平衡溶液进行清洗3～6遍，使用前利用台盼蓝染色进行细胞活力的检测，脂肪间充质干细胞活率大于80%的条件下，将脂肪间充质干细胞与关节注射用透明质酸溶液进行充分混合后，至细胞浓度为5×106～5×107；该脂肪间充质干细胞混悬液即为脂肪间充质干细胞制剂。...

【技术特征摘要】
1.一种用于治疗骨性关节炎的脂肪间充质干细胞制剂的制备方法，其特征是：第一步，微囊化脂肪间充质干细胞的制备：收集培养结束的3代-10代的脂肪间充质干细胞，将脂肪间充质干细胞充分、均匀的混悬在海藻酸钠、羧甲基壳聚糖、聚乙二醇-4000三种物质混合配制的溶液中，其中三种物质的浓度分别为1%～3%、1%～3%、4～10%，其基础溶剂为生理盐水，脂肪间充质干细胞悬浮在混合液中的终浓度控制在1×105～1×106，将含有脂肪间充质干细胞的混合液加入到微量注射器中，然后注射到含40～100mmol/L的CaCl2的DMEM培养液中，控制出液的液珠球径不大于0.5mm，将含脂肪间充质干细胞的液珠在含CaCl2的液体中静置30秒～1分钟形成凝胶微球，然后将凝胶微球转到DMEM培养基中待用；第二步，制备动物来源的软骨细胞与滑膜细胞：准备6～12月大的哺乳动物，利用生理盐水配制木瓜蛋白酶与胶原酶的混合酶液，木瓜蛋白酶的浓度为2%～6%，其中胶原酶采用II型胶原酶,II型胶原酶的浓度为1%～3%,将混合酶液每隔2～3天注射0.2～0.5mL到每只哺乳动物的髋关节中，一共注射3～6次，注射完成后的半个月到2个月后，打开髋关节，可见关节软骨有明显的变性时取出滑膜组织与软骨组织；第三步，对脂肪间充质干细胞的炎症性诱导：将滑膜组织与软骨组织取出后，利用无菌的平衡液清洗多遍，将滑膜组织和软骨组织剪切成体积较为1mm×1mm×1mm的小组织块，将组织块放入培养瓶中，倒入少量含10%胎牛血清的DMEM培养液，培养液略微覆盖组织块表面，在37℃、5%CO2浓度、95%湿度...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐丽君，吴道安，奕志娟，
申请(专利权)人：杭州元研细胞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33