一种用于禽流感病毒通用型直接RT-PCR检测的引物和探针及试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种用于禽流感病毒通用型直接荧光RT‑PCR检测的引物和探针及试剂盒，包括禽流感病毒的检测引物和检测探针以及内标RNA的探针。采用本发明专利技术的引物和探针，能够实现直接将液体样本加入反应体系，在一个PCR管中连续、自动实现病毒RNA的释放、反转录和荧光定量PCR检测；实现了无需提取病毒RNA、直接从采取的样本中检测禽流感病毒的目的，从得到待检测样本到获得检测结果只需要1.5个小时；有效克服了传统RT‑PCR需要提取RNA的不足，能大大减少操作步骤，大幅度提高检测速度，节省成本，有效避免交叉污染。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及病毒检测
，尤其涉及一种用于禽流感病毒通用型直接RT-PCR检测的引物和探针及试剂盒。
技术介绍
禽流感(AvianInfluenza,AI)也叫欧洲鸡瘟或真性鸡瘟，是由A型流感病毒引起的一种急性高度接触性传染病，是国际公认的一种毁灭性疾病，可以经猪或其它动物传播给人，因此具有十分重要的生态学和公共卫生学意义，尤其是高致病性禽流感被世界动物卫生组织列为A类传染病。近年来发现禽流感不仅严重危害禽类，而且危害哺乳动物，尤其是可以感染人并致人死亡，极大地威胁着人类公共卫生安全。禽流感病毒为单股副链RNA病毒，共分为8个节段。其中7节段即M基因全长为1027bp，编码2种蛋白M1和M2。在M基因编码的蛋白中，M1蛋白具有种群特异性，是病毒分类和诊断的基础。目前，检测禽流感病毒的方法包括病毒的分离和培养和酶联免疫吸附(ELISA)等，但这些方法在灵敏性和特异性方面仍存在一定不足。反转录PCR(RT-PCR)技术由于灵敏性和特异性较高，已经成为禽流感病毒检测的常用方法。但常规RT-PCR需要进行后续电泳鉴定，易发生交叉污染而产生假阳性，且操作耗时较长。相比之下，荧光定量PCR技术(real-timeRT-PCR)具有更高的灵敏性，且无需PCR后续处理，能有效避免交叉污染并提高检测效率，然而进行病毒RNA提取不仅增加了时间和成本，难以实现高通量检测，而且提取RNA的过程仍容易发生RNA降解或交叉污染等事件，另外对于痕量样本，提取RNA仍存在较大困难。因此，现有的基于RT-PCR检测禽流感病毒的方法还有待于改进和发展。为了提高禽流感病毒检测效率、节省成本、避免交叉污染并进行高通量检测，一种较好的解决方案是设法实现禽流感病毒直接扩增的RT-PCR检测，即直接以采集的液体样本作为检测对象进行RT-PCR反应。然而，受限于引物和探针易受样本复杂因素的影响，目前还没有找到可以这样使用的引物和探针。
技术实现思路
本专利技术提供一种用于禽流感病毒通用型直接荧光RT-PCR检测的引物和探针及试剂盒。采用本专利技术的引物和探针或试剂盒，并结合其它常规试剂组分，能够实现在一个PCR管中连续、自动进行病毒RNA的释放、反转录和荧光定量PCR检测；从得到检测样本到获得检测结果只需要1.5个小时；灵敏性、准确性可与传统RT-PCR相媲美；克服了传统RT-PCR需要提取RNA这一繁琐步骤的不足，减少操作步骤，提高检测速度，节省成本，有效避免交叉污染，能进行禽流感病毒的高通量检测，对快速发现禽流感疫情，及时制定防控措施具有重要的意义。根据本专利技术的第一方面，本专利技术提供一种用于禽流感病毒通用型直接扩增的RT-PCR检测的引物和探针序列，包括：一对禽流感病毒的检测引物，其序列如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示；一条禽流感病毒的检测探针，其序列如SEQIDNO:3所示；该序列的3’端结合荧光淬灭基团，5’端结合荧光报告基团；一条内标RNA的探针，其序列如SEQIDNO:4所示；该序列的3’端结合荧光淬灭基团，5’端结合荧光报告基团。作为本专利技术的优选方案，上述探针SEQIDNO:3的3’端结合BHQ1(BlackHoleQuencher-1，黑洞淬灭染料-1)荧光淬灭基团，5’端结合FAM(6-carboxy-fluorescein，6-羧基荧光素)荧光报告基团；上述探针SEQIDNO:4的3’端结合BHQ3荧光淬灭基团，5’端结合CY5荧光报告基团。根据本专利技术的第二方面，本专利技术提供一种用于禽流感病毒通用型直接扩增的RT-PCR检测的试剂盒，包括检测引物、检测探针和内标探针，上述检测引物的序列如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示，上述检测探针的序列如SEQIDNO:3所示，该序列的3’端结合荧光淬灭基团，5’端结合荧光报告基团；上述内标探针如SEQIDNO:4所示，该序列的3’端结合荧光淬灭基团，5’端结合荧光报告基团。作为本专利技术的优选方案，上述探针SEQIDNO:3的3’端结合有BHQ1荧光淬灭基团，5’端结合有FAM荧光报告基团；上述探针SEQIDNO:4的3’端结合BHQ3荧光淬灭基团，5’端结合CY5荧光报告基团。作为本专利技术的优选方案，上述试剂盒包括禽流感病毒通用型内标溶液；优选地，上述内标溶液通过将禽流感病毒通用型M基因克隆至RNA假病毒表达载体pAR中并将得到的质粒pAR-AIVUN通过大肠杆菌转化的方法制备。作为本专利技术的优选方案，上述试剂盒还包括反转录酶和TaqDNA聚合酶。作为本专利技术的优选方案，上述试剂盒还包括PCR增强剂；优选地，上述PCR增强剂选自肉碱(L-carnitine)、甜菜碱(Glycinebetaine)、海藻糖(D-(+)-trehalose)、非离子去污剂NP-40中的一种或多种。作为本专利技术的优选方案，上述试剂盒的检测对象为咽喉拭子液、泄殖腔拭子液、组织渗出液或尿囊液。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：采用本专利技术的引物和探针，能够实现直接将液体样本加入反应体系，在一个PCR管中连续、自动实现病毒RNA的释放、反转录和荧光定量PCR检测；实现了无需提取病毒RNA、直接从采取的样本中检测禽流感病毒的目的，从得到待检测样本到获得检测结果只需要1.5个小时；有效克服了传统RT-PCR需要提取RNA的不足，能大大减少操作步骤，大幅度提高检测速度，节省成本，有效避免交叉污染。此外，本专利技术的试剂盒还可以含有多种PCR增强剂，包括但不限于肉碱、甜菜碱、海藻糖、非离子去污剂NP-40，它们既能提高GC含量基因的扩增效率，增加反应体系对PCR抑制物质的耐受性，有效降低抑制物质的荧光淬灭效应，同时NP-40还有助于裂解病毒外壳来释放RNA。采用本专利技术的引物和探针的RT-PCR检测方法的灵敏性不低于传统RT-PCR，甚至在低浓度PBS或体液的情况下灵敏性高于传统RT-PCR。附图说明图1为本专利技术实施例1中RNA假病毒表达质粒载体pAR-AIVUN的图谱；图2为本专利技术实施例2中禽流感病毒通用型直接扩增的RT-PCR检测方法与提取RNA的传统RT-PCR方法检测咽拭子液样本的灵敏性比较图；图3为本专利技术实施例2中禽流感病毒通用型直接扩增的RT-PCR检测方法与提取RNA的传统RT-PCR方法检测尿囊液样本的灵敏性比较图；图4为本专利技术实施例3中禽流感病毒通用型直接扩增的RT-PCR检测方法对不同浓度咽拭子液(10～40％)的耐受能本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于禽流感病毒通用型直接荧光扩增的RT‑PCR检测的引物和探针序列，其特征在于，包括：一对禽流感病毒的检测引物，其序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；一条禽流感病毒的检测探针，其序列如SEQ ID NO:3所示；该序列的3’端结合荧光淬灭基团，5’端结合荧光报告基团；一条内标RNA的探针，其序列如SEQ ID NO:4所示；该序列的3’端结合荧光淬灭基团，5’端结合荧光报告基团。

【技术特征摘要】
1.一种用于禽流感病毒通用型直接荧光扩增的RT-PCR检测的引物和探针序列，其特征在于，包括：
一对禽流感病毒的检测引物，其序列如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示；
一条禽流感病毒的检测探针，其序列如SEQIDNO:3所示；该序列的3’端结合荧光淬灭基团，5’端结合荧光报告基团；
一条内标RNA的探针，其序列如SEQIDNO:4所示；该序列的3’端结合荧光淬灭基团，5’端结合荧光报告基团。
2.根据权利要求1所述的引物和探针序列，其特征在于，所述探针SEQIDNO:3的3’端结合BHQ1荧光淬灭基团，5’端结合FAM荧光报告基团；所述探针SEQIDNO:4的3’端结合BHQ3荧光淬灭基团，5’端结合CY5荧光报告基团。
3.一种用于禽流感病毒通用型直接扩增的RT-PCR检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测引物、检测探针和内标探针，所述检测引物的序列如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示，所述检测探针的序列如SEQIDNO:3所示，该序列的3’端结合荧光淬灭基团，5’端...

【专利技术属性】
技术研发人员：翟建新，孙彦伟，卢受昇，林琳，潘艳萍，吴晓卫，高慧敏，邓国栋，余希尧，张利，
申请(专利权)人：深圳澳东检验检测科技有限公司，广东省动物卫生监督总所，
类型：发明
国别省市：广东;44