一种快速鉴定H7N9禽流感病毒的引物组、试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开了一种快速鉴定H7N9禽流感病毒的HRM检测方法及其引物组，该方法同样适合于H7亚型禽流感病毒和N9亚型禽流感病毒的检测。该方法操作简单：只需在PCR反应之前加荧光饱和染料即可；检测速度快且高通量：全部操作过程只需2‑3小时，极大缩短了分型所需时间；费用低，不需要特异性荧光标记探针，每个样品的饱和染料成本为1.6 RMB；准确性高、特异性好，重复性好，可以准确、快速、高通量地进行分析，有利于在临床检测中推广应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及病毒的分子检测方法，具体涉及一种快速鉴定H7N9禽流感病毒的引物组、试剂盒及方法。
技术介绍
2013年3月，中国国家卫生和计划生育委员会宣布在上海、安徽地区发现了人感染H7N9亚型流感病毒事件，由于这种新型重组H7N9流感病毒未曾有过感染人或者动物的报道，因此出现了一系列亟待解决的问题，引起了全世界范围的广泛关注。截止目前，全国已有20多个省份发现了H7N9病例，而且病例数和死亡数还在持续增加。虽然从家禽和环境中分离的家禽H7N9流感病毒对家禽无致病力，但存在变异成高致病性毒株的风险。为加强源头控制，及时发现、逐步剔除H7N9流感病毒，切实保障畜禽产品安全和公共卫生安全，农业部组织实施了《全国家禽H7N9流感剔除计划》。因此，建立H7N9流感病毒的快速检测方法十分必要。H7N9禽流感病毒传统的检测方法，是采取病毒分离培养后，结合血凝和血凝抑制方法做出确诊（WangWenbo，PengHaoran，TaoQingyuan，eta1．Serologicassayforavian-origininfluenzaA(H7N9)virusinadultsofShanghai，GuangzhouandYunnan，China[J]JClinVirol，2014，60(3)：305—308．），但该方法全国只有指定的有限实验室可以开展，且存在费时费力的缺点，难以推广。鉴于此，国家相关部门建议采用核酸检测方法对其进行检测，核酸检测主要采用常规RT-PCR和荧光定量RT-PCR技术。常规RT-PCR方法需要针对HA基因和NA基因分别扩增，跑胶鉴定，或配合基因测序，检测费时费力。近年来，科研工作者陆续建立了系列荧光定量方法（陈奕磊，等，一种利用实时荧光定量PCR检测H7N9禽流感病毒的引物及方法[P].浙江：CN104388589A,2015-03-04；陈奕磊，等，一种利用实时荧光定量PCR检测H7N9禽流感病毒的试剂盒[P].浙江：CN103233082A,2013-08-07；谢芝勋，等，H7N9禽流感病毒二重荧光定量RT-PCR检测试剂盒[P].广西：CN103255236A,2013-08-21；李兰娟，等，一种检测甲型流感病毒H7N9亚型的荧光定量RT-PCR试剂盒[P].浙江：CN103275862A,2013-09-04；罗思思，等，H7N9亚型AIV双重实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立[J].动物医学进展,2013,12:1-5.），该方法虽然特异性、灵敏度较高，但需要用到至少两条荧光标记探针，检测成本较高。所以建立一种特异性和灵敏度较高，且成本较低的快速检测方法具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一种快速鉴定H7N9禽流感病毒的HRM检测引物组。本专利技术的目的之二在于提供一种快速鉴定H7N9禽流感病毒的HRM检测方法。本专利技术的目的之三在于提供一种快速鉴定H7N9禽流感病毒的HRM检测试剂盒。本专利技术所采取的技术方案是：一种快速鉴定H7N9禽流感病毒的引物，其核苷酸序列如下所示：引物P1：GTTTAGCTTCGGGGCAT（SEQIDNO：1），引物P2：CAAATAGTGCACCGCATG（SEQIDNO：2），引物P3：AGGGAGRACAATAAGCACA（SEQIDNO：3），引物P4：TTTATCCTCCTTGGGTCTY（SEQIDNO：4）。一种快速鉴定H7N9禽流感病毒的试剂盒，该试剂盒含有上述所述的引物。一种快速鉴定H7N9禽流感病毒的方法，包括以下步骤：1）从样品中提取病毒核酸；2）以提取的核酸为模板，用权利要求1所述的引物P1、P2、P3、P4及荧光饱和染料进行RT-PCR扩增反应获得扩增产物；3）对扩增产物进行HRM分析，确定病毒是否为H7N9禽流感病毒；上述方法用于非疾病的诊断和治疗。进一步的，步骤2）中RT-PCR扩增反应体系为：模板RNA2μLPrimeScript1StepEnzymeMix1μL2×1StepBuffer12.5μL10mM引物P11μL10mM引物P21μL10mM引物P31μL10mM引物P41μLSyto91μLRNaseFreeddH2O4.5μL总体积25μL。进一步的，步骤2）中的RT-PCR扩增反应程序为：50℃反转录30min；95℃预变性3min；95℃变性15s，56℃退火15s，72℃延伸15s；循环35次。进一步的，步骤3）中的HRM分析程序为：98℃变性2min，40℃杂合2min，74℃到85℃以0.3℃/s的熔解速率进行熔解曲线分析。进一步的，步骤3）中所述HRM分析的具体分析过程为：以H7N9阳性对照品作参考，若样品只形成一个熔解峰，且Tm值为77.92±0.25℃，则检测样品中含有H7亚型禽流感病毒；若样品只形成一个熔解峰，且Tm值为81.92±0.35℃，则检测样品中含N9亚型禽流感病毒；若样品形成两个熔解峰，且两个熔解峰的Tm值分别为77.92±0.25℃、81.92±0.35℃，则检测样品中含有H7N9禽流感病毒。本专利技术的有益效果是：1）本专利技术首次建立了一种快速鉴定H7N9禽流感病毒的HRM检测方法及其引物组，操作简单：只需在PCR反应之前加入荧光饱和染料即可；检测速度快且高通量：全部操作过程只需2-3小时，极大缩短了分型所需时间；费用低，不需要特异性荧光标记探针，每个样品的饱和染料成本为1.6RMB；准确性高、特异性好，重复性好，可以准确、快速、高通量地进行分析，有利于在临床实践中推广应用。2）本专利技术两对引物P1、P2、P3、P4对H7N9禽流感病毒均有很好的扩增性，有利于提高本专利技术对快速鉴定H7N9禽流感病毒分析的扩增效率。3）本专利技术的PCR-HRM引物特异性好，引物对P1和P2除可以与H7亚型禽流感病毒结合外，不与其他常见禽源病毒，如新城疫病毒（Newcastlediseasevirus,NDV）、鸡传染性支气管炎病毒（AvianInfectiousBronchitisVirus,IBV）、H5N1、H5N6、H3N2、H9N2、H6N2亚型禽流感病毒等核酸结合，仅特异性扩增H7亚型禽流感病毒核酸；引物对P3和P4除可以与N9亚型禽流感病毒结合外，不与其他常见禽源病毒，如新城疫病毒（Newcastlediseasevirus,NDV）、鸡传染性支气管炎病毒（AvianInfectiousBronchitisVirus,IBV）、...

【技术保护点】
一种快速鉴定H7N9禽流感病毒的引物，其核苷酸序列如下所示：引物P1：GTTTAGCTTCGGGGCAT（SEQ ID NO：1），引物P2：CAAATAGTGCACCGCATG（SEQ ID NO：2），引物P3：AGGGAGRACAATAAGCACA（SEQ ID NO：3），引物P4：TTTATCCTCCTTGGGTCTY（SEQ ID NO：4）。

【技术特征摘要】
1.一种快速鉴定H7N9禽流感病毒的引物，其核苷酸序列如下所示：
引物P1：GTTTAGCTTCGGGGCAT（SEQIDNO：1），
引物P2：CAAATAGTGCACCGCATG（SEQIDNO：2），
引物P3：AGGGAGRACAATAAGCACA（SEQIDNO：3），
引物P4：TTTATCCTCCTTGGGTCTY（SEQIDNO：4）。
2.一种快速鉴定H7N9禽流感病毒的试剂盒，其特征在于：该试剂盒含有权利要求1所述
的引物。
3.一种快速鉴定H7N9禽流感病毒的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）从样品中提取病毒核酸；
2）以提取的核酸为模板，用权利要求1所述的引物P1、P2、P3、P4及荧光饱和染料进行
RT-PCR扩增反应获得扩增产物；
3）对扩增产物进行HRM分析，确定病毒是否为H7N9禽流感病毒；
上述方法用于非疾病的诊断和治疗。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤2）中RT-PCR扩增反应体系为：
模板RNA2μL
PrimeScript1StepEnzymeMix1μL
2×1StepBuffer12.5μL
10mM引物...

【专利技术属性】
技术研发人员：张春红，李林林，刘志成，孙敏华，沈海燕，张建峰，
申请(专利权)人：广东省农业科学院动物卫生研究所，
类型：发明
国别省市：广东;44