一种沉默植物基因表达的方法技术

本发明专利技术公开了一种沉默植物基因表达的方法，包括如下步骤：步骤一，根据目的基因序列设计并合成300‑400bp可形成发夹结构的小RNA片段备用；步骤二，把含有目标基因的植物组培苗切除根部，然后转入添加2,4‑D和NAA的固体培养基中，在伤口处诱导愈伤组织；步骤三，把带有愈伤组织的试管苗，转入添加有小RNA片段的MS液体培养基中，并使小RNA片段的浓度为200‑500μM；步骤四，步骤三于20‑30℃下培养一周后检测目的基因的表达情况。本发明专利技术在完整的植物试管苗上诱导愈伤组织，然后转入添加小RNA片的液体培养基中进行培养，从而达到抑制目的基因的目的。

【技术实现步骤摘要】


本专利技术涉及生物工程领域中的基因表达
，特别是涉及一种沉默植物基因表达的方法。

技术介绍

RNA干扰（RNAinterference,RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-strandedRNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象，目前已成为植物基因工程中沉默基因表达的最常用技术之一。然而RNA干扰最终是通过植物转基因技术才能得以实现，所以其在植物中的应用范围非常小，仅限于具有成熟遗传转化体系的品种。动物细胞溶液中直接加入小RNA后可以抑制目标基因的表达，然而成熟植物细胞的细胞壁阻止了小RNA的进入。研究表明，植物的愈伤组织由薄壁细胞组成，其通透性明显优于成熟细胞。所以愈伤组织是植物基因进行RNA干扰的一个理想材料。
申请公布号为CN104603269A，专利技术名称为用于在丝状真菌菌株中共沉默基因表达的方法及其应用的中国专利申请，公开了一种用于在丝状真菌菌株中共沉默编码生物物质的基因的表达的方法，包括：(a)向该丝状真菌菌株的基因组中插入一个双链可转录核酸构建体，该构建体包括一个可操作地连接至一个第一多核苷酸的启动子，该第一多核苷酸包括一个与编码第一生物物质的第一靶基因具有同源性的第一可转录区，一个第二多核苷酸，该第二多核苷酸包括一个与编码第二生物物质的第二靶基因具有同源性的第二可转录区，以及一个第三多核苷酸，该第三多核苷酸包括一个与该第一和第二靶基因无有效同源性的第三可转录区；其中该第三可转录区包括两个在相反方向上彼此互补的区段；并且其中该第一、第二和第三可转录区被转录为一个单链RNA分子；并且(b)通过以下产生短干扰RNA(siRNA)：将该丝状真菌菌株在一定条件下培养，以产生该双链可转录核酸构建体的RNA转录本，这些RNA转录本然后被转化为siRNA，这些siRNA与这些靶基因的RNA转录本相互作用，以沉默编码该第一和第二生物物质的靶基因的表达。
该方法仅使用于丝状真菌菌株，并且其表达方法较为复杂，周期较长。

技术实现思路

为了克服上述现有技术的不足，本专利技术提供了一种沉默植物基因表达的方法，其目的在于。
本专利技术所采用的技术方案是：一种沉默植物基因表达的方法，包括如下步骤：
步骤一，根据目的基因序列设计并合成300-400bp可形成发夹结构的小RNA片段备用；
步骤二，把含有目标基因的植物组培苗切除根部，然后转入添加2,4-D和NAA的固体培养基中，在伤口处诱导愈伤组织；
步骤三，把步骤二得到带有愈伤组织的试管苗，转入添加有小RNA片段的MS液体培养基中，并使小RNA片段的浓度为200-500μM；
步骤四，步骤三于20-30℃下培养一周后检测目的基因的表达情况。
本专利技术在完整的植物试管苗上诱导愈伤组织，然后转入添加小RNA片的液体培养基中进行培养，小RNA进入愈伤组织的薄壁细胞后，可发生长距离运输，最后导致整个植株中的目的基因沉默，从而达到抑制目的基因的目的。本专利技术可操作性强，实验周期短，特别适合难以建立遗传转化体系的植物，具有较大的应用价值。
本专利技术的进一步改进在于,步骤二和步骤三中愈伤组织来自切除根部的植物组织培养苗，而非离体组织,植物沉默效果更佳。
本专利技术的进一步改进在于,步骤三于25℃下培养两周后检测目的基因的表达情况。
本专利技术的进一步改进在于,步骤二中的固体培养基为MS培养基。
本专利技术的进一步改进在于,步骤四于25℃下执行一周后，使用荧光定量PCR，检测PPS植物基因的表达情况。
本专利技术的进一步改进在于,植物为小蔓长春花或韭菜。
与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术在完整的植物试管苗上诱导愈伤组织，然后转入添加小RNA片的液体培养基中进行培养，小RNA进入愈伤组织的薄壁细胞后，可发生长距离运输，最后导致整个植株中的目的基因沉默，从而达到抑制目的基因的目的。本专利技术可操作性强，实验周期短，特别适合难以建立遗传转化体系的植物，具有较大的应用价值。
具体实施方式
为了加深对本专利技术的理解，下面结合实施例对本专利技术进一步说明，该实施例仅用于解释本专利技术，并不对本专利技术的保护范围构成限定。
实施例1
一种沉默植物基因表达的方法，包括如下步骤：
步骤一，根据目的基因序列设计并合成300-400bp可形成发夹结构的小RNA片段备用；
步骤二，把含有目标基因的植物组培苗切除根部，然后转入添加2,4-D和NAA的固体培养基中，在伤口处诱导愈伤组织；
步骤三，把步骤二得到带有愈伤组织的试管苗，转入添加有小RNA片段的MS液体培养基中，并使小RNA片段的浓度为200-500μM；
步骤四，步骤三于20-30℃下培养一周后检测目的基因的表达情况。
本专利技术在完整的植物试管苗上诱导愈伤组织，然后转入添加小RNA片的液体培养基中进行培养，小RNA进入愈伤组织的薄壁细胞后，可发生长距离运输，最后导致整个植株中的目的基因沉默，从而达到抑制目的基因的目的。本专利技术可操作性强，实验周期短，特别适合难以建立遗传转化体系的植物，具有较大的应用价值。
在上述实施例中,步骤二和步骤三中愈伤组织来自切除根部的植物组织培养苗，而非离体组织,植物沉默效果更佳。步骤三于25℃下培养两周后检测目的基因的表达情况。
步骤二中的固体培养基为MS培养基。
在上述实施例中,步骤四于25℃下执行一周后，使用荧光定量PCR，检测PPS植物基因的表达情况。
实施例2
本实施例对小蔓长春无菌苗中FPS基因进行RNA。本实施例的小蔓长春花苗来自本实验室。
本实施例所述MS培养基采用Murashige和Skoog（1962）公开的培养基，MS培养基在现有的生物以及农业等领域有着广泛的应用。具体成分如表1：
表1MS培养基配方
本试验的详细步骤如下：
步骤一，根据小蔓长春花中FPS基因序列，设计并合成360bp可形成发夹结构的小RNA片段，加水后形成300μM的水溶液备用；
步骤二，把完整的小蔓长春花试管苗切除根部，然后转入添加2,4-D2mg/L的固体培养基中，在伤口处诱导愈伤组织；
步骤三，把步骤二得到带有愈伤组织的试管苗，转入添加有小RNA片段的MS液体培养基中，小RNA片段的浓度为300μM；
步骤四，步骤三于25℃下执行15天后，通过荧光定量PCR，检测PPS基因的表达情况。
本实施例对20棵小蔓长春花无菌嫁接苗进行了检测，结果17棵苗中FPS基因被沉默，剩下的3棵与对照相比，FPS基因的表达水平也有明显降低。
实施例3
本实施例对小蔓长春花无菌苗中FPS基因进行RNA。本实施例的小蔓长春花苗来自本实验室。
本试验的详细步骤如下：
步骤一，根据小蔓长春花中FPS基因序列，设计并合成350bp可形成发夹结构的小RNA片段，加水后形成250μM的水溶液备用；
步骤二，把完整的小蔓长春花试管苗切除根部，然后转入添加2,4-D2mg/L的固体培养基中，在伤口处诱导愈伤组织；
步骤三，把步骤二得到带有愈伤组织的试管苗，转入添加有小RNA片段的MS液体培养基中，小RNA片段的浓度为250μM；
步骤四，步骤三于25℃下执行18天后，通过荧光定量PCR，检测PPS基因的表达情况。
本实施例对30棵小蔓长本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种沉默植物基因表达的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一，根据目的基因序列设计并合成300‑400bp可形成发夹结构的小RNA片段备用；步骤二，把含有目标基因的植物组培苗切除根部，然后转入添加2,4‑D和NAA的固体培养基中，在伤口处诱导愈伤组织；步骤三，把步骤二得到带有愈伤组织的试管苗，转入添加有小RNA片段的MS液体培养基中，并使小RNA片段的浓度为200‑500μM；步骤四，步骤三于20‑30℃下培养一周后检测目的基因的表达情况。

【技术特征摘要】
1.一种沉默植物基因表达的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，根据目的基因序列设计并合成300-400bp可形成发夹结构的小RNA片段备用；
步骤二，把含有目标基因的植物组培苗切除根部，然后转入添加2,4-D和NAA的固体培养基中，在伤口处诱导愈伤组织；
步骤三，把步骤二得到带有愈伤组织的试管苗，转入添加有小RNA片段的MS液体培养基中，并使小RNA片段的浓度为200-500μM；
步骤四，步骤三于20-30℃下培养一周后检测目的基因的表达情况。
2.根据权利要求1所述的一种沉默植物基因表达的方法，其特征在于：步骤二和步骤三中所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐宁，陈全战，张边江，王立科，杨平，
申请(专利权)人：南京晓庄学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32