一种结直肠癌相关的标志物、其引物及应用制造技术

本发明专利技术涉及结直肠癌相关的标志物、其引物及应用，本发明专利技术选取miRNA‑218为血浆标志物，合成其引物，应用于结直肠癌检测和结直肠癌检测试剂盒中。本发明专利技术的技术方案检测结直肠癌灵敏度高，特异性强，患者依从性高，适合大量筛查。

【技术实现步骤摘要】


本专利技术属于基因工程及肿瘤学领域，具体涉及一种结直肠癌相关的标志物、其引物及应用。

技术介绍

结直肠癌是消化道最常见的恶性肿瘤之一，全球范围内每年新发病例数约100万/年，死亡人数约50万。随着生活水平的提高，饮食习惯的改变，我国结直肠癌发病率逐年提高，居恶性肿瘤发病率第4位。近25年来，结直肠癌已成为我国发病率增长最快的恶性肿瘤，每年大约有14万新患病例，占全部癌症患者的6.8％。据预测，我国结直肠癌的发病率与死亡率在今后很长一段时期内将稳步上升，成为我国最常见、发病率上升最快的恶性肿瘤之一。尽管手术、化疗、放疗等综合治疗手段不断改进，仍有25%左右的结直肠癌出现复发和转移。因此，对结直肠癌的早期诊断是降低结直肠癌发病率和死亡率的有效手段。目前临床常用的肿瘤标志物如CEA、CA19-9等特异性不高，急需寻找更为有效的结直肠癌筛查标记物。
microRNA（miRNA）为小的非编码RNA，长度为19-24bp。在人类，miRNA主要通过特异性识别靶mRNA的3′-UTR并与之结合，从而作用于靶mRNA的翻译，进而调节其蛋白表达。miRNA几乎在所有的细胞生物学进程中发挥重要的调控作用，包括个体发育、细胞增殖、分化、代谢、凋亡和应激等。约1/3的人类蛋白编码基因受miRNA的调控。miRNA失衡表达可促进多种人类疾病尤其是肿瘤的发生发展。约50%的已知人类miRNA基因定位于与肿瘤相关的染色体区域，如miR-181参与B细胞的分化；miR-223参与粒细胞的分化；miR-17-92促进细胞的增殖。肿瘤组织普遍具有特征性的miRNA表达，即肿瘤细胞miRNA表达水平常与同一组织中的正常细胞存在显著的差异，而且不同的肿瘤类型表达也有区别，用miRNA的表达来区分肿瘤的类型比蛋白编码的mRNA更准确。因此特征性的miRNA表达作为有效的工具用于肿瘤的诊断、预后和治疗的反应性等显示了良好的临床应用前景。虽然肿瘤组织miRNA表达谱往往与癌症预后更为相关，但无法应用于临床早期诊断。由于miRNA的小分子特性及易于释放入血，血清miRNA能够作为癌症或其他疾病的分子标记物，提供非损伤性的早期诊断癌症的手段。肺癌糖尿病患者均存在疾病特异性血清miRNA表达谱。血清miR-141的表达可以作为前列腺癌早期诊断的标志物。
近年来研究表明，结直肠癌的发生发展可能与miRNA的异常表达密切相关。但结论并不统一，因此在临床研究中依然需要寻找高效特异的结直肠癌筛查标记物。

技术实现思路

本专利技术所要解决的技术问题是，提供一种结直肠癌相关的血浆miRNA标志物、其引物、其用途及一种结直肠癌检测试剂盒。
本专利技术采用的技术方案是，一种结直肠癌相关的血浆miRNA标志物，该标志物为miRNA-218，其序列为SEQIDNo.5：5’-UUGUGCUUGAUCUAACCAUGU-3’。
所述血浆miRNA标志物的一种引物，该引物为SEQIDNo.1：5’-GGTTGTGCTTGATCTAACCATGTG-3’和No.2：5’-GCTGTCAACGATACGCTACGTA-3’。
一种miRNA-218的新用途，其作为结直肠癌相关的血浆miRNA标志物。
本专利技术同时提供所述的血浆miRNA标志物在制备结直肠癌检测试剂盒中的应用；所述的血浆miRNA标志物的引物在制备结直肠癌检测试剂盒中的应用。
一种结直肠癌检测试剂盒，用于检测血浆中miRNA-218。
进一步的，其包含所述的引物。
进一步的，试剂盒还包括内参miRNA，所述内参miRNA为人工合成的RNAControl，其序列为SEQIDNo.3：5’-AAAUCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3’。
进一步的，试剂盒包括反转录引物，其序列为SEQIDNo.4：5’-GCTGTCAACGATACGCTACGTATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3’，其中V=A、G、或C，N=A、G、C、或T。
进一步的，试剂盒的全部组成成分为：
（1）血清总RNA提取试剂；
（2）miRNA加尾试剂；
（3）cDNA合成试剂；
（4）实时定量荧光PCR试剂；
其中cDNA合成试剂中包括序列为SEQIDNo.4的反转录引物，实时定量荧光PCR试剂中包括序列为SEQIDNo.1结直肠癌特异性标志物miR-218的正向引物、序列为SEQIDNo.2的反向引物及序列为SEQIDNo.3的RNAcontrol。
miRNA-218作为血浆检测标志物，在结直肠癌患者中显示出明显的特异性，其应用于试剂盒中，检测灵敏度高，特异性强，适合大量筛查。
传统的结直肠癌检测以组织为样本，患者在抽样过程中创面大、检测时间长，患者的依从性差，本专利技术的试剂盒以血浆为样本，操作方便，患者依从性高。
本专利技术的试剂盒灵敏度高，操作方便，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1：血浆miR-218在结直肠癌患者组与健康人对照组中的ROC曲线。
具体实施方式
1血清中RNA的提取
抽取35名结直肠癌患者外周血2mL，同时抽取35名健康人外周血2mL，分离血清后，取400uL血清置于RNase/DNase-free离心管中。按miRNeasySerum/Plasmakit试剂盒（Qiagen）说明书抽提血清中的总RNA，并在提取过程中按照每400uL血清加入1uL（20nM）序列为5’-AAAUCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3’的人工合成RNAControl，（广州锐博生物科技有限公司）来检测血清中总RNA提取效率，提取的总RNA使用NanoDrop微量分光光度计测量浓度。
2血清中miRNA检测
（1）加尾
由于miRNA较为短小，常规检测方式无法完成对miRNA的检测。为后期检测方便，本专利技术增加了miRNA的长度。在RNase/DNase-free的PCR管中（生工生物工程有限公司）配置加尾反应体系，体系包括：polyA聚合酶2U（TAKARA公司），加尾缓冲液2uL，100mMdATP0.2uL（Fermentas公司），40U/uLRNA酶抑制剂1uL（Fermentas公司），总RNA1ug，用RNase/DNase-freewater补齐体系至20uL。轻轻混匀反应体系，并将配置好反应体系的PCR管放入PCR仪（Bio-rad）中进行加尾反应，反应条件为：37℃孵育1小时。
（2）逆转录合成cDNA
向加尾反应所得的反应液中加入0.5ug序列为5’-GCTGTCAACGATACGCTACGTATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3’V=(A，G，orC)N=(A，G，C，orT)的引物（生工生物工程有限公司），75℃孵育5分钟，立即至于冰上5分钟。之后分别加入逆转录缓冲液10uL（Promega公司），10mMdNTPMix2.5uL（Fermentas公司），40U/uLRNA酶抑制剂2uL（Fermentas公司），200U/uLMMLV逆转录酶400U（Promega公司），用RNase/DNase-freewater补齐体系至50uL。42℃本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种结直肠癌相关的血浆miRNA标志物，其特征在于，该标志物为miRNA‑218。

【技术特征摘要】
1.一种结直肠癌相关的血浆miRNA标志物，其特征在于，该标志物为miRNA-218。
2.权利要求1所述的血浆miRNA标志物的引物，其特征在于，该引物为SEQIDNo.1和No.2。
3.一种miRNA-218的新用途，其特征在于，作为结直肠癌相关的血浆miRNA标志物。
4.权利要求1所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：翟从劼，赵增仁，姜霞，李芳，张立科，陈英，王胜杰，
申请(专利权)人：河北医科大学第一医院，
类型：发明
国别省市：河北;13