基于绿色荧光蛋白发光结构域标记的抗乙肝表面抗原抗体的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种基于绿色荧光蛋白发光结构域标记的抗乙肝表面抗原抗体的制备方法。该制备方法通过基因工程手段，包括如下步骤：合成融合基因GFP‑F‑Domain‑anti‑HBsAg的第一DNA序列；以所述第一DNA序列为模板进行扩增，获得第二DNA序列；将所述第二DNA序列连接至表达载体pET22b质粒上，获得第一目的克隆组；将所述第一目的克隆组分别诱导表达，获得第一细菌群；将所述经过诱导表达的第一细菌群破碎、纯化，获得基于绿色荧光蛋白发光结构域标记的抗乙肝表面抗原抗体。通过本发明专利技术提供的制备方法提高了乙肝表面抗原定量检测的准确性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种基于绿色荧光蛋白发光结构域标记的抗乙肝表面抗原抗体的制备方法。
技术介绍
据世界卫生组织统计，全球有20亿人感染过乙肝病毒。每年有近100万人死于乙肝病毒慢性感染引起的肝硬化或肝癌等疾病。乙肝表面抗原(HBsAg)定量检测是评价慢乙肝治疗效果的重要手段。中华医学会发布的2015年版《慢性乙型肝炎防治指南》指出：对血清中的乙肝表面抗原进行定量监测，可用于预测疾病进展、抗病毒疗效和预后，停药后获得持久的HBsAg消失为慢乙肝治疗的理想终点。目前用于乙肝表面抗原定量检测方法，均以抗原-抗体识别为基础。抗乙肝表面抗原抗体(anti-HBsAg)在酶标板上分散均匀度和抗体的稳定性，直接影响乙肝表面抗原的定量。然而目前市面上尚没有评估抗乙肝表面抗原抗体的方法，给乙肝表面抗原的定量检测带来不确定性。传统方法多采用了绿色荧光蛋白融合表达的方法，即在目的蛋白质的碳端或者氮端连接绿色荧光蛋白实现标记。然而，绿色荧光蛋白体积太大，会待标记的目的蛋白质的正确折叠产生影响。因此，设计一种体积小相对较小的绿色荧光蛋白发光结构域(GFP-F-Domain)标记的抗乙肝表面抗原抗体的制备方法，以保证乙肝表面抗原定量检测的准确性，是本领域亟待解决的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种基于绿色荧光蛋白发光结构域标记的抗乙肝表面抗原抗体的制备方法，旨在保证乙肝表面抗原定量检测的准确性。为实现上述目的，本专利技术提供一种基于绿色荧光蛋白发光结构域标记的抗乙肝表面抗原抗体的制备方法。所述基于绿色荧光蛋白发光结构域标记的抗乙肝表面抗原抗体的制备方法包括如下步骤：S1：合成融合基因GFP-F-Domain-anti-HBsAg的第一DNA序列；S2：以所述第一DNA序列为模板，扩增所述第一DNA序列，获得第二DNA序列；S3：将所述第二DNA序列连接至表达载体pET22b质粒，获得第一目的克隆组；S4：将所述第一目的克隆组分别诱导表达，获得第一细菌群；S5：破碎所述经过诱导表达的第一细菌群，进行纯化，获得基于绿色荧光蛋白发光结构域标记的抗乙肝表面抗原抗体。优选地，所述步骤S3包括如下步骤：S31：纯化第二DNA序列，获得第三DNA序列；S32：利用限制性内切酶处理所述第三DNA序列，获得第四DNA序列；S33：利用限制性内切酶处理表达载体pET22b质粒，获得线性化的pET22b质粒，即第五DNA序列；S34：连接所述第四DNA序列和所述第五DNA序列，获得第一连接产物；S35：将第一预设量的所述第一连接产物和第二预设量的BL21菌株感受态细胞混合，转化并筛选培养，获得阳性克隆组；S36：筛选所述阳性克隆组，进行测序验证，获得第一目的克隆组。优选地，所述步骤S5包括如下步骤：S51：超声破碎所述第一细菌群，获得上清液；S52：利用镍离子亲和柱纯化所述上清液，获得洗脱液；S53：利用蛋白冻干的方法处理所述洗脱液，获得绿色荧光蛋白发光结构域标记的抗乙肝表面抗原抗体。优选地，所述步骤S2中扩增所述第一DNA序列的引物GFP-F-Domain-anti-HBsAg-F的DNA序列为atgccaacacttgtcactac，引物GFP-F-Domain-anti-HBsAg-R的DNA序列为cttgacttcagcacggtc。优选地，所述融合基因GFP-F-Domain-anti-HBsAg的第一DNA序列包括位于所述融合基因GFP-F-Domain-anti-HBsAg的5’端的编码绿色荧光蛋白GFP发光结构域的DNA序列、位于3’端的编码anti-HbsAg蛋白的DNA序列，以及位于5’端和3’端之间的连接肽DNA序列。优选地，所述融合基因GFP-F-Domain-anti-HBsAg的第一DNA序列为单链DNA序列。优选地，所述限制性内切酶为NdeI和XhoI。优选地，所述第一预设量为20μL，所述第二预设量为100μL。优选地，连接所述第四DNA序列和所述第五DNA序列时的温度为16℃。本专利技术提供的基于绿色荧光蛋白发光结构域标记的抗乙肝表面抗原抗体的制备方法，将编码绿色荧光蛋白GFP发光结构域的DNA序列与编码anti-HBsAg蛋白的DNA序列融合在一起；利用GFP的荧光基团标记anti-HBsAg蛋白，根据检测到的荧光强度，即可换算出anti-HBsAg蛋白的含量。本专利技术所采用的绿色荧光蛋白发光结构域由58个氨基酸组成，与组成GFP的238氨基酸相比，分子量变为原来的四分之一。本专利技术采用体积小相对较小的绿色荧光蛋白发光结构域(GFP-F-Domain)标记抗乙肝表面抗原抗体，提高了乙肝表面抗原定量检测的准确性。附图说明图1为本专利技术基于绿色荧光蛋白发光结构域标记的抗乙肝表面抗原抗体的制备方法的流程示意图；图2为本专利技术较佳实施例中步骤S3的细化流程示意图；图3为本专利技术较佳实施例中步骤S5的细化流程示意图。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术做进一步的详细说明，以下实施例是对本专利技术的解释，本专利技术并不局限于以下实施例。在本专利技术实施例中，乙肝表面抗原的英文缩写为HBsAg，是乙肝病毒基因编码的分泌蛋白；抗乙肝表面抗原抗体的英文缩写为anti-HBsAg，是特异识别乙肝表面抗原的抗体；GFP即绿色荧光蛋白(GreenFluorescentProtein)；dNTPs为脱氧核糖核苷三磷酸；pET22b质粒为一种常用于基因工程的质粒，为目的基因的表达载体；BL21菌株，是一种常用的具有蛋白质表达功能的大肠杆菌菌株。参照图1，图1为本专利技术基于绿色荧光蛋白发光结构域标记的抗乙肝表面抗原抗体的制备方法的流程示意图。所述基于绿色荧光蛋白发光结构域标记的抗乙肝表面抗原抗体的制备方法包括如下步骤：S1：合成融合基因GFP-F-Domain-anti-HBsAg的第一DNA序列；具体地，所述融合基因GFP-F-Domain-anti-HBsAg的第一DNA序列包括位于所述融合基因GFP-F-Domain-anti-HBsAg的5’端的编码绿色荧光蛋白GFP发光结构域GFP-F-Domain的DNA序列、位于3’端的编码anti-HbsAg蛋白的DNA序列，以及位于5’端和3’端之间的连接肽DNA序列。所述GFP-F-DomainDNA序列如核苷酸序列表所示；所述GFP-F-Domain蛋白质...

【技术保护点】
一种基于绿色荧光蛋白发光结构域标记的抗乙肝表面抗原抗体的制备方法，其特征在于，所述基于绿色荧光蛋白发光结构域标记的抗乙肝表面抗原抗体的制备方法包括如下步骤：S1：合成融合基因GFP‑F‑Domain‑anti‑HBsAg的第一DNA序列；S2：以所述第一DNA序列为模板，扩增所述第一DNA序列，获得第二DNA序列；S3：将所述第二DNA序列连接至表达载体pET22b质粒，获得第一目的克隆组；S4：将所述第一目的克隆组分别诱导表达，获得第一细菌群；S5：破碎所述经过诱导表达的第一细菌群，进行纯化，获得基于绿色荧光蛋白发光结构域标记的抗乙肝表面抗原抗体。

【技术特征摘要】
1.一种基于绿色荧光蛋白发光结构域标记的抗乙肝表面抗原抗体的制备
方法，其特征在于，所述基于绿色荧光蛋白发光结构域标记的抗乙肝表面抗
原抗体的制备方法包括如下步骤：
S1：合成融合基因GFP-F-Domain-anti-HBsAg的第一DNA序列；
S2：以所述第一DNA序列为模板，扩增所述第一DNA序列，获得第二
DNA序列；
S3：将所述第二DNA序列连接至表达载体pET22b质粒，获得第一目的
克隆组；
S4：将所述第一目的克隆组分别诱导表达，获得第一细菌群；
S5：破碎所述经过诱导表达的第一细菌群，进行纯化，获得基于绿色荧
光蛋白发光结构域标记的抗乙肝表面抗原抗体。
2.如权利要求1所述的基于绿色荧光蛋白发光结构域标记的抗乙肝表面
抗原抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤S3包括如下步骤：
S31：纯化第二DNA序列，获得第三DNA序列；
S32：利用限制性内切酶处理所述第三DNA序列，获得第四DNA序列；
S33：利用限制性内切酶处理表达载体pET22b质粒，获得线性化的pET22b
质粒，即第五DNA序列；
S34：连接所述第四DNA序列和所述第五DNA序列，获得第一连接产物；
S35：将第一预设量的所述第一连接产物和第二预设量的BL21菌株感受
态细胞混合，转化并筛选培养，获得阳性克隆组；
S36：筛选所述阳性克隆组，进行测序验证，获得第一目的克隆组。
3.如权利要求1或2所述的基于绿色荧光蛋白发光结构域标记的抗乙肝
表面抗原抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤S5包括如下步骤：
S51：超声破碎所述第一细菌群，获得上清液；
S52：利用镍离子亲和柱纯化所述上清液，获得洗脱液；
S53：利用蛋白冻干的方法处理所述洗脱液，获得基于绿色...

【专利技术属性】
技术研发人员：周晓莹，胡立夫，英格玛·恩伯格，埃姆郎·纳瓦什，
申请(专利权)人：深圳市圣必智科技开发有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44