一种人干扰素IFN-α2b与LL-37的融合蛋白制造技术

本发明专利技术公开了人干扰素IFN-α2b与人抗菌肽LL-37的基因改造、融合表达与纯化。所获得的IFN-α2b与LL-37融合蛋白同时具有IFN-α2b的抗病毒活性和LL-37的抗菌活性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物工程

技术介绍
蛋白的结构常常可以容许包括整个结构域的插入与融合，在自然界中，通过结构域的插入与融合从而形成大的多功能蛋白是一种较为普遍存在的现象。重组DNA技术的应用使得不同基因或基因片段的融合可以比较方便地进行，融合的基因经表达后即可得到由不同的功能蛋白拼合在一起而形成的新型多结构域的人工蛋白，这是一种极具潜在应用价值与理论意义的方法。目前这种方法已被广泛应用于许多领域的研究中，并已显示出较高的价值。基因融合技术最早即是被用来在细菌(主要是大肠杆菌)中表达外源蛋白，对于外源基因，利用融合表达的方法在大肠杆菌中表达有很多优点，一是由于外源基因一般是被连接到可供融合的蛋白的C端编码序列之后，因此不需另外设SD序列，同时，N端融合基因的存在，使得外源基因的表达相对比较容易。其二是外源基因的表达产物常常会被宿主细胞的蛋白酶所降解，当外源基因与宿主本身的某种蛋白(如β一半乳糖普酶)的部分编码序列构成融合基因，以融合蛋白的形式表达时，往往会减低宿主细胞对产物的降解。除此之外，利用融合蛋白的形式表达外源基因产物还有以下的一些特殊的优点，包括：通过融合表达为蛋白纯化提供便利；通过融合表达的方式促使产物以包涵体的形式表达等。故本专利技术将人干扰素-α2b和人LL-37融合。IFN-α2b是由165个氨基酸组成的单链多肽，Cys1和Cys98，Cys29和Cys138组成二条二硫键。人LL-37全长37个氨基酸，分子内无二硫键，其N端丝氨酸被乙酞化，但缺少乙酞化对其活性影响不大。由于基因工程菌的重组人LL-37无法实现乙酞化，为此考虑将人LL-37置于融合蛋白的C端。因此如何设计一个适合连接肽是该分子设计的关键。若连接肽太长，两个药物的协同作用可能减弱，若太短，可能影响到干扰素α2b与受体的结合，只有适宜的连接肽不仅将两个药物连接成一个大分子，而且不会影响到两个药物保持各自的功能。该融合蛋白采用十几个氨基酸残基的连接肽，使得两个药物不仅较好地保持各自的功能，而且具有协同效果。
技术实现思路
1.人LL-37与IFN-α2bDNA序列的密码子优化在保证人LL-37与IFN-α2b氨基酸序列完整性的前提下，按照P.pastoris对密码子的偏好性特点，对他们的DNA序列进行优化。2重组人干扰素α2b和人LL-37融合蛋白表达载体构建分别用EcoRI和NotI双酶切pPIC9K和pMD-18Fall-IFN质粒，经凝胶电泳后切胶分别回收约9300bp和600bp的片断，用胶回收试剂盒回收片断，并用T4ligase连接，构建分泌型重组质粒pPIC9K-Fall-IFN，用CaCl法转化大肠杆菌DH5α，利用LB-Amp平板筛选重组子。挑选阳性转化子送上海生工进行测序，确定质粒的结构。3重组质粒转化毕赤酵母用SacI单酶切pPIC9K-Fall-IFN成线性重组质粒，通过电击转化法将其转入P.pastorisGS115中构建重组菌P.pastorisGS115LI。电击条件为1500kV，200Ω，25μF。转化液涂布于MD平板30℃静止培养3天，挑选阳性克隆，摇瓶后，用真菌基因组提取试剂盒提取基因组进行PCR鉴定。引物为：SenseP1：ATGTGTGACCTACCACAAACCCACA，AntisP2：GGACTCTGTCCTGGGTACAAGATT，退火温度为58℃，以GS115基因组及未加模板的体系为对照组。4重组菌表型鉴定及多拷贝筛选通过甲醇利用情况进行重组菌表型鉴定。将PCR鉴定的阳性转化子编号，并将每菌株用灭菌牙签同时接种MD和MM平板，30℃静止培养5天，观察各菌株在两种平板上的生长情况。通过遗传霉素(G418)浓度梯度筛选多拷贝重组株。首先制备遗传霉素质量浓度为0.25、0.5、1.0、2.0、3.0mg/mL的YPD平板，然后将前面筛选的表型正常的重组菌株用灭菌牙签点在5个遗传霉素梯度平极上，30℃静止培养4天，观察结果，能在高浓度下生长良好的菌株为多拷贝菌株。5融合蛋白发酵与纯化将筛选的重组菌株，接种于25mLBMGY培养液中，30℃250rpm/min培养约16h，至菌液OD600≈5，4℃4000rpm/min离心5min，收集菌体，用25mLBMMY培养液重悬细胞，诱导培养，每24h按体积比为0.5％加入纯甲醇，连续诱导144h以上，4℃12000rpm/min离心5min，收集上清于-20℃冻存待用。上清液中的融合蛋白先用85％饱和度(NH4)2SO4盐析，4℃静止20～24小时，12000rpm/min离心15分钟收集盐析沉淀并溶于适量去离子水，用pH7.2、10mmol/L磷酸缓冲液透析除硫酸铵。透析结束后离心除不溶物得到粗融合蛋白溶液。将融合蛋白粗液先在起始缓冲液中平衡，然后上CM32阳离子交换纤维素柱，从0.1mol/L至0.3mol/LAAB梯度洗脱，收集含IFN-α2b-LL-37融合蛋白的洗脱成分。将上柱收集液用pH7.5、25mmol/L磷酸缓冲液平衡后上DEAE-52阴离子交换纤维素柱，从含0.1mol/L至0.3mol/L的NaCl的Ph7.5、25mmol/L磷酸缓冲液梯度洗脱，收集含IFN-α2b-LL-37融合蛋白的洗脱成分。再将上述收集液经冷冻干燥浓缩至1半体积，上SephadexG-100凝胶层板柱，用pH7.5、25mmol/L磷酸缓冲液洗脱，收集含IFN-α2b-LL-37融合蛋白的洗脱成分。6IFN-α2b与LL-37融合蛋白的检测6.1融合蛋白纯度检测用SDS-PAGE法检测融合蛋白纯度，检测参照文献进行。以Takara蛋白分子质量标准(低)为Marker。以未经诱导的发酵液为空白对照。6.2融合蛋白浓度检测以牛血清白蛋白为标准，按Lowry法测定融合蛋白浓度。6.3融合蛋白产物活性分析培养液中IFN-α2b的活性分析参照《中国药典2010版》中《干扰素效价测定(细胞病变抑制法)》。活性标准品购自广州市药品检测所。以总IFN-α2b活性计算纯化过程中的回收率。培养液中LL-37的活性测定参照文献17。用大肠杆菌ATCC25922以及ML35p作为检测菌种，用双层琼脂糖打孔法测定。底层培养基上打直径3mm的圆孔，每孔加10μL发酵液，37℃孵化3h后，在底层上覆盖一层营养琼脂，37℃继续培养20h，测量无菌生长的透明环直径。抗菌活性以下式计算：抗菌活性单位(U)＝(抗菌环直径-3)×10附图说明图1重组质粒pBlue-IFN-α2b-LL的构建流程图2重组质粒pBlue-IFN-α2b-LL构建产物的PCR鉴定1：DNAMarker2000；2：用Ph1和Pc2从重组质粒pBlure-IFN-LL中扩增的IFN-LL基因；3：用Pc1和Pc2从重组质粒pBlure-IFN-LL中扩增的LL-37基因；4、5：空白对照。图3PCR检验pBlue-IFN-α2b-LL本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人干扰素IFN‑α2b与LL‑37的融合蛋白，其是：a)具有与SEQ ID No.1的1‑232位氨酸序列所示的肽链，或b)在SEQ ID No.1基础上通过缺失、突变、重组获得的具有人干扰素IFN‑α2b与LL‑37活性的多肽。

【技术特征摘要】
1.一种人干扰素IFN-α2b与LL-37的融合蛋白，其是：
a)具有与SEQIDNo.1的1-232位氨酸序列所示的肽链，或
b)在SEQIDNo.1基础上通过缺失、突变、重组获得的具有人干扰素IFN-α2b与LL-37活性的多肽。
2.权利要求1的IFN-α2b与LL-37的融合蛋白，由人IFN-α2b通过接头GlyGlyGlyGlySer与LL-37
相连。
3.权利要求1的...

【专利技术属性】
技术研发人员：万徐萍，
申请(专利权)人：广东紫金正天药业有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44