间充质干细胞培养试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了间充质干细胞培养试剂盒，包括细胞培养液A和细胞培养液B；所述细胞培养液A为含80～120ng/ml细胞因子LIF、80～120ng/ml细胞因子bFGF和20～30μg/mlGranulodiene A的Knockout‑DMEM培养基；所述细胞培养液B为胎牛血清。采用本发明专利技术提供的细胞培养液将脐带间充质干细胞传代15次后，细胞仍然维持很高的纯度和良好的全能性。采用本发明专利技术提供的细胞培养液培养骨髓间充质干细胞，也取得了同样好的效果。这些结果表明，本发明专利技术提供的培养试剂盒能够提高间充质干细胞原代细胞传代时间，使间充质干细胞多次传代后依然保持有细胞全能性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于干细胞培养领域，具体涉及一种间充质干细胞培养试剂盒。
技术介绍
间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSC)是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层。MSC最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。如间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。间充质干细胞包括脐带间充质干细胞和骨髓间充质干细胞。脐带间充质干细胞是一类具有自我更新、增殖和多向分化潜能的干细胞，具有来源广泛、易于采集、保存和运输、无异体排斥、避免伦理争议等诸多优点。流式细胞仪分析发现脐带间充质干细胞高表达间质细胞标志(CD44、CD105)、整合素受体(CD29、CD49b、CD49c、CD51)、不表达造血系标志(CD34、CD45)白细胞抗原HLA-DR和内皮细胞标志CD31。脐带间充质干细胞在体内外可以分化为骨细胞、软骨细胞、肝细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞以及神经元细胞等。目前人脐带间充质干细胞在组织工程骨、人工血管以及基因治疗等临床应用研究中已逐渐深入，并已显示出广阔的应用前景。目前，对脐带间充质干细胞的分离培养、扩增还没有统一的标准，存在纯度低、原代培养时间长等缺点。各种类型的成纤维成体干细胞扩增一般在2～3天开始进入指数式生长，相差不大，而原代细胞由于组织来源不同，出现细胞克隆时间差异较大，所以，原代细胞传代时间是分离得到目的细胞的关键。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种能够提高间充质干细胞原代细胞传代时间的培养试剂盒，以使间充质干细胞多次传代后依然保持有细胞全能性。本专利技术的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：一种间充质干细胞培养试剂盒，包括细胞培养液A和细胞培养液B；所述细胞培养液A为含80～120ng/ml细胞因子LIF、80～120ng/ml细胞因子bFGF和20～30μg/mlGranulodieneA的Knockout-DMEM培养基；所述细胞培养液B为胎牛血清。进一步地，所述细胞培养液A为含100ng/ml细胞因子LIF、100ng/ml细胞因子bFGF和25μg/mlGranulodieneA的Knockout-DMEM培养基。进一步地，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞。进一步地，所述间充质干细胞为骨髓间充质干细胞。进一步地，所述细胞培养液A和细胞培养液B均为无菌，并各自独立包装。进一步地，所述的间充质干细胞培养试剂盒还包括细胞洗涤液和细胞消化液；所述细胞洗涤液为生理盐水；所述细胞消化液为CollagenaseII水溶液。进一步地，所述细胞消化液为浓度为0.2g/100ml的CollagenaseII水溶液。进一步地，所述生理盐水由氯化钠和水组成，氯化钠的浓度为0.9g/100ml。进一步地，所述细胞培养液A、细胞培养液B、细胞洗涤液和细胞消化液均为无菌，并各自独立包装。上述间充质干细胞培养试剂盒在间充质干细胞培养中的应用。本专利技术的优点：本专利技术提供的培养试剂盒能够提高间充质干细胞原代细胞传代时间，使间充质干细胞多次传代后依然保持有细胞全能性。具体实施方式下面结合实施例进一步说明本专利技术的实质性内容，但并不以此限定本专利技术保护范围。尽管参照较佳实施例对本专利技术作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本专利技术的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本专利技术技术方案的实质和范围。本专利技术化合物GranulodieneA的制备方法参见文献：SesquiterpenesfromthesaprotrophicfungusGranulobasidiumvellereum(Ellis&Cragin)Jülich,Phytochemistry102(2014)197-204。实施例1：试剂盒的制备1、组分的制备细胞洗涤液的制备：将9gNaCl溶于去离子水并用去离子水定容至1000ml，高压灭菌后置于4℃冰箱内备用。细胞培养液A的制备：将细胞因子LIF、细胞因子bFGF和化合物GranulodieneA溶于无菌Knockout-DMEM培养基(液体)，细胞因子LIF的浓度为100ng/ml，细胞因子bFGF的浓度为100ng/ml，化合物GranulodieneA的浓度为25μg/ml。置于4℃冰箱内备用。细胞培养液B为无菌胎牛血清，置于-20℃冰箱内备用。细胞消化液：将CollagenaseII溶于去离子水使CollagenaseII的浓度为0.2g/100ml，置于4℃冰箱内备用。2、组分的分装以及试剂盒的制备用于分离脐带间充质干细胞的试剂盒(1次/盒)由独立包装的如下组分组成：1瓶细胞洗涤液(100ml/瓶)、1瓶细胞培养液A(80ml/瓶)，1瓶细胞培养液B(20ml/瓶)和1瓶细胞消化液(100ml/瓶)。实施例2：试剂盒的制备，与实施例1对比，仅细胞培养液A中不添加GranulodieneA1、组分的制备细胞洗涤液的制备：将9gNaCl溶于去离子水并用去离子水定容至1000ml，高压灭菌后置于4℃冰箱内备用。细胞培养液A的制备：将细胞因子LIF和细胞因子bFGF溶于无菌Knockout-DMEM培养基(液体)，细胞因子LIF的浓度为100ng/ml，细胞因子bFGF的浓度为100ng/ml。置于4℃冰箱内备用。细胞培养液B为无菌胎牛血清，置于-20℃冰箱内备用。细胞消化液：将CollagenaseII溶于去离子水使CollagenaseII的浓度为0.2g/100ml，置于4℃冰箱内备用。2、组分的分装以及试剂盒的制备用于分离脐带间充质干细胞的试剂盒(1次/盒)由独立包装的如下组分组成：1瓶细胞洗涤液(100ml/瓶)、1瓶细胞培养液A(80ml/瓶)，1瓶细胞培养液B(20ml/瓶)和1瓶细胞消化液(100ml/瓶)。实施例3：脐带间充质干细胞的分离与快速扩增培养分别用实施例1(实验组)和实施例2(对照组)制备的试剂盒进行脐带间充质干细胞的分离与快速扩增培养。细胞培养液的制备：将细胞培养液A和细胞培养液B按照5:1的体积比混合。1、无菌收集离体脐带(来源为人)，浸没于含双抗的细胞培养液(含双抗本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种间充质干细胞培养试剂盒，其特征在于：包括细胞培养液A和细胞培养液B；所述细胞培养液A为含80～120ng/ml细胞因子LIF、80～120ng/ml细胞因子bFGF和20～30μg/ml GranulodieneA的Knockout‑DMEM培养基；所述细胞培养液B为胎牛血清。

【技术特征摘要】
1.一种间充质干细胞培养试剂盒，其特征在于：包括细胞培养液A和细胞培养液B；
所述细胞培养液A为含80～120ng/ml细胞因子LIF、80～120ng/ml细胞因子bFGF和
20～30μg/mlGranulodieneA的Knockout-DMEM培养基；
所述细胞培养液B为胎牛血清。
2.根据权利要求1所述的间充质干细胞培养试剂盒，其特征在于：所述细胞培养液A为
含100ng/ml细胞因子LIF、100ng/ml细胞因子bFGF和25μg/mlGranulodieneA的
Knockout-DMEM培养基。
3.根据权利要求1所述的间充质干细胞培养试剂盒，其特征在于：所述间充质干细胞为
脐带间充质干细胞。
4.根据权利要求1所述的间充质干细胞培养试剂盒，其特征在于：所述间充质干细胞为
骨髓间充质干细胞。
5.根据权利要求1所述的间充...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵顺英，
申请(专利权)人：赵顺英，
类型：发明
国别省市：江苏;32