本发明专利技术涉及一种外切型糖胺聚糖裂解酶及其编码基因与应用。外切型糖胺聚糖裂解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；外切型糖胺聚糖裂解酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；本发明专利技术所述的外切型糖胺聚糖裂解酶可以降解还原端标记的硫酸软骨素四糖；是一种从还原端降解糖胺聚糖的外切型糖胺聚糖降解酶；运用这种酶可以成功的对硫酸化的硫酸软骨素的六糖和八糖进行测序，可应用于糖胺聚糖的构效关系研究中，具有广阔的科研前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术设及，属于基因工程技术 领域。
技术介绍
糖胺聚糖(glycosaminoglycan，GAG)，曾被称为粘多糖、氨基多糖和酸性多糖，为 杂多糖的一种。主要包括透明质酸化yaluronic Acid，HA)，肝素/硫酸乙酷肝素化eparin/ 胎paran Sulfate，Hep/HS)，硫酸软骨素/硫酸皮肤素（畑ondroitin Sulfate/Dermatan Sulfate，CS/DS)，硫酸角质素化eratan Sulfate,KS)。它是由重复二糖单位组成的直链多 糖，除硫酸角质素的二糖单位是由中性的D-半乳糖和N-乙酷葡糖胺组成W外，其它糖胺聚 糖的二糖单位均是由己糖醒酸(D-葡萄糖醒酸A-艾杜糖醒酸)与己糖胺(N-乙酷葡萄糖胺/ N-乙酷半乳糖胺)组成。其中透明质酸结构相对简单，由D-葡萄糖醒酸和N-乙酷葡糖胺组成 的二糖单位经e-1,4-糖巧键连接而成。其它糖胺聚糖则由于各种修饰酶的作用使糖链变得 异常复杂，主要表现在糖链中不同部位径基(-OH)和氨基(-NH2)的硫酸化，D-葡萄糖醒酸在 C5-差向异构酶的作用下转变为k艾杜糖醒酸，己糖胺二位氨基的乙酷化等。糖胺聚糖糖链 结构的运种高度复杂性不是随机发生的，而是具有高度的时空特异性，是各种糖链合成相 关酶在不同细胞组织和器官的不同发育阶段表达调控水平所致，不同的结构使其具有不同 的功能，结构的复杂性赋予其功能的多样性。 糖胺聚糖广泛存在于动物细胞细胞膜表面和胞外基质中，通过与各种蛋白的特异 相互作用参与了细胞的增值和分化、细胞间的识别、细胞转移、组织形态发生、癌变等各种 生理和病理过程（Knudson and Knudson 1993,Perrimon and Bernfield 2000,Karbownik and Nowak 2013)，糖胺聚糖所具有的一系列重要的生物学功能使其成为重要的生物活性 分子，在医药及功能食品中得到广泛应用，如肝素、硫酸软骨素、透明质酸(Noble 2002， Jiang，Liang et al.2007)等。近年来的大量研究表明，糖胺聚糖的生物功能是通过多糖链 中具有特殊结构的功能区与特定蛋白的特异相互作用来实现的，同一多糖链中存在不同结 构的功能区，与不同的蛋白相互作用可W行使不同的功能，为了研究与特定蛋白作用的结 构功能区的特点，需要对其进行构效关系研究分析。 糖胺聚糖降解酶是研究糖胺聚糖构效关系的重要工具酶，主要包括微生物来源的 裂解酶系和动物来源的水解酶系。根据底物的不同可分为透明质酸酶、硫酸软骨素/硫酸皮 肤素降解酶、肝素/硫酸乙酷肝素降解酶、硫酸角质素降解酶四大类。依据降解机制的不同 又可W分为内切型糖胺聚糖降解酶和外切型糖胺聚糖降解酶。内切型糖胺聚糖降解酶较 多，如来自绵羊和牛睾丸的透明质酸水解酶(Zaneveld，化Iakoski et al.l973)，可W在酸 性抑下将透明质酸完全降解为四糖和六糖;而来自链霉菌的透明质酸裂解酶可W降解透明 质酸，终产物是非还原端带不饱和双键的四糖和六糖(Ohya and Kaneko 1970);微生物来 源的硫酸软骨素裂解酶(CSase)，如CSase ABC-I和CSase AC-I除了降解硫酸软骨素/硫酸 皮肤素外还都表现出一定的透明质酸降解活性，但CSase B是高度专一性硫酸皮肤素降解 酶，对硫酸软骨素和透明质酸均无降解活性。外切型硫酸软骨素降解酶较少，如来自于 Proteus vulgaris的Csase ABC-II(Hashimoto 1997)和来自于Artherobacter aurescens 的CSase AC-IKHiyama and Okada 1975)具有外切型硫酸软骨素降解酶的特性，其中前者 是从多糖或寡糖的非还原端切割，而后者是从糖链的还原端切割，它们在糖链测序中有着 重要应用。但是当糖链的还原端被巧光标记后将严重影响酶对糖链的切割，特别是对CSase AC-II运种从还原端切割的外切酶。 综上所述，糖胺聚糖降解酶是糖胺聚糖结构功能研究必不可少的工具，其中外切 型糖胺聚糖降解酶对于糖胺聚糖活性寡糖的测序研究有着特别重要的应用价值。因此寻找 和鉴定新型外切型糖胺聚糖降解酶具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供一种外切型糖胺聚糖裂解酶及其编码基因与应 用。 -种外切型糖胺聚糖裂解酶，氨基酸序列如(a)或(b)所示：[000引 （a)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示； (b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有外切型 糖胺聚糖裂解酶活性的由(a)衍生的蛋白质。根据本专利技术优选的，所述氨基酸序列（b)如沈Q ID NO. 3或沈Q ID NO.4所示。 -种外切型糖胺聚糖裂解酶的编码基因，核巧酸序列如（i)或（ii)所示：[001^ (i)核巧酸序列如SEQ ID NO. 1所示； (ii)在严格条件下与（i)限定的DNA序列杂交且编码具有外切型糖胺聚糖裂解酶 活性的蛋白质的DNA分子。 根据本专利技术优选的，所述核巧酸序列（ii)中所述严格条件下，是指：[001引在含0.5 % SDS的6 X SSC缓冲液中，在65 °C下杂交，然后用含0.1 % SDS的2 X SSC缓 冲液和含0.1 % SDS的1 X SSC缓冲液各洗膜一次。 根据本专利技术进一步优选的，所述核巧酸序列Qi)如SEQ ID NO. 5或SEQ ID NO.6。 -种重组表达载体，在表达载体中插入了上述外切型糖胺聚糖裂解酶的编码基 因。 根据本专利技术优选的，所述表达载体选自大肠杆菌表达载体、酵母表达载体、枯草杆 菌表达载体、乳酸菌表达载体、链霉菌表达载体、隧菌体载体、丝状真菌表达载体、植物表达 载体、昆虫表达载体、或哺乳动物细胞表达载体。 -种重组菌或转基因细胞系，在宿主细胞或细胞系中插入了上述外切型糖胺聚糖 裂解酶的编码基因。 根据本专利技术优选的，所述宿主细胞选自大肠杆菌宿主细胞、酵母菌宿主细胞、枯草 杆菌宿主细胞、乳酸菌宿主细胞、放线菌宿主细胞或丝状真菌宿主细胞;所述细胞系选自昆 虫细胞或哺乳动物细胞。 用于重组表达外切型糖胺聚糖裂解酶的重组菌可W是大肠杆菌宿主细胞（如 Escherichia coli BL21、Escherichia coli JM109、Escherichia coli D册曰等）、酉奉母菌 宿主细胞（女曰Saccharomyces cerevisiae、Pichia pastoris、Kluyveromyces Iactis等）、 枯草杆菌宿主细胞（如Bacillus subtilis R25、Bacillus subtilis 9920等）、乳酸菌宿主 细胞（如Lactic acid bacteria C0CC101 等）、放线菌宿主细胞（如Str邱tomyces spp.等） 或丝状真菌宿主细胞（如Trichoderma viride,IYichoderma reesei,Aspergillus niger、 Aspergillus nidulans等）；转基因细胞系可W是昆虫细胞（如Bombyxmori ,Antharaea euca本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种外切型糖胺聚糖裂解酶，其特征在于，氨基酸序列如(a)或(b)所示：(a)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有外切型糖胺聚糖裂解酶活性的由(a)衍生的蛋白质。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李福川，蔡晓娟，王文爽，韩文君，韩乃寒，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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