本发明专利技术公开了牛PSMA5基因RNA干扰载体的构建与筛选及在奶牛乳腺上皮细胞中的表达，首先设计出4条待选的shRNA序列以及1条阴性对照序列，构建RNA干扰载体，然后转染到奶牛乳腺上皮细胞(MAC-T)中，最后利用实时荧光定量PCR和Western Blotting技术分别检测PSMA5在奶牛乳腺上皮细胞中mRNA和蛋白水平的表达。本发明专利技术构建了PSMA5基因RNA干扰载体，转染奶牛乳腺上皮细胞，并利用实时荧光定量PCR及western blotting的方法分别在mRNA和蛋白水平检测PSMA5基因的表达情况，为进一步揭示PSMA5在乳腺的CLA内源性合成中的作用提供技术依据。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因生物领域，具体涉及一种牛PSMA5基因RNA干扰载体的构建与筛选及在奶牛乳腺上皮细胞中的表达。
技术介绍
PSMA5基因具有多种生物学功能，它是26s蛋白酶体的组成元件，26s蛋白酶体负责细胞大多数蛋白质的降解，它是生物体内的重要降解途径，关系到很多生物进程。在之前的蛋白组学研究中发现，PSMA5在乳腺的共轭亚油酸(CLA)内源性合成中表达上调，因此推测PSMA5可能参与CLA的内源性合成。CLA是亚油酸的同分异构体，是一系列含有碳8、9、10、11开始的共轭双键，具有位置和几何异构的十八碳二烯酸的异构体的总称。CLA是近几十年来，在反刍动物中发现的一种对人体有益的功能性不饱和脂肪酸。它具有令人瞩目的生理活性，如抗癌、抗动脉硬化症、抗糖尿病、提高免疫力、改善骨组织代谢、抑制脂肪沉积等生物学功能。因此，如何提高CLA合成的含量成为近几十年来国内外的一个研究热点。在自然界CLA主要以cis-9，trans-11CLA的形式存在于反刍动物的乳制品和肉制品中。前期的研究可知牛奶中CLA主要通过乳腺中内源性合成而来，但是其合成机制还不明确。目前的研究仅仅知道TVA可以通过硬脂酰辅酶A去饱和酶SCD的去饱和作用转化成CLA，但除了SCD以外还可能存在其他的蛋白参与并调控CLA的合成。尽管以现有的营养调控手段可以提高牛奶中CLA的含量，但是其含量还远不能发挥CLA的最佳生理功效。因此只有对乳腺中CLA合成的调控机制进行深入的研究，明确乳腺中内源性合成CLA的机制，才能利用分子营养学手段来进一步提高乳中CLA的含量。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术提供了牛PSMA5基因RNA干扰载体的构建与筛选及在奶牛乳腺上皮细胞中的表达。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：牛PSMA5基因RNA干扰载体的构建与筛选及在奶牛乳腺上皮细胞中的表达，包括如下步骤：S1、在NCBI上查询牛PSMA5基因的CDS区序列，根据shRNA的设计原则在invitrogen的shRNA在线设计网站上设计PSMA5基因的shRNA靶序列；S2、选择4条合适的shRNA靶序列以及一条阴性对照序列，根据pLVX-shRNA2-puro质粒的酶切位点以及shRNA的设计原则在选择的shRNA靶序列上加上酶切位点、茎环结构和终止转录的序列，送到华大基因合成；S3、将正义链(100uM)5ul；反义链(100uM)5ul；10X退火缓冲液5ul；ddH2035ul混合后置于水浴锅中，95℃加热5min后，关闭水浴锅自然降温至30℃以下，取样电泳，切胶回收退火产物，置于-20℃备用；S4、用EcoRI、BamHI限制性内切酶双酶切pLVX-shRNA2-puro空质粒，37℃，4h，酶切体系如下：pLVX-shRNA2-puro空质粒20ul；EcoRI限制性内切酶1ul；BamHI限制性内切酶1ul；10XCutSmart缓冲液5ul；ddH2023ul；S5、将所得退火产物与所得的双酶切的pLVX-shRNA2-puro空质粒用T4DNA连接酶连接，16℃，过夜；S6、将测序正确的菌液进行无内毒素质粒大提，提取的质粒以备转染细胞；将MAC-T细胞培养到汇合度为80％时，传代到6孔板中，24h后进行细胞转染，按照lipofectamineTM2000说明操作，转染48h后检测荧光；S7、收集转染后48h的细胞，提取RNA，-80℃备用，筛选出最有效的shRNA重新转染细胞，待细胞汇合度大于90％后，更换分化培养基；分化培养4days后提取RNA和总蛋白，-80℃备用；S8、在NBCI上找到牛的内参基因β-actin和PSMA5的CDS区序列，用primerpremier5软件设计引物，送华大基因合成，引物序列如下：β-actin-F：5’CAGCAAGCAGGAGTACGATG3’；β-actin-R：5’AGCCATGCCAATCTCATCTC3’；PSMA5-F：5’CCTTCGGAGTAGCACTGTTAT3’；PSMA5-R：5’CTCTGAGCACCCTCTGAAGC3’；反应体系如下：2XFastStartUniversalSYBRGreenMaster(Rox)10ul；引物(上)0.4ul；引物(下)0.4ul；模板cDNA1ul；ddH208.2ul；S9、按照如下程序进行实时荧光定量PCR：首先在95℃运行2min，之后40个PCR循环(95℃10s；60℃34s)；之后95℃1min；55℃30s；95℃30s；S10、采用2-△△ct法计算荧光定量结果，在4条设计的shRNA序列中选取干扰效率最高的一条，再转染细胞，进行后续的Westernblotting检测。其中，所述步骤S5中的连接体系如下：退火产物1ul；pLVX-shRNA2-puro双酶切产物1ul；T4DNA连接酶1ul；10XT4DNA连接酶缓冲液1ul；ddH206ul。其中，所述Westernblotting检测包括如下步骤：首先将总蛋白用BCA试剂盒进行浓度测定，按每孔10ug的量上样，电泳时间为70v，3小时；120v，2小时；采用半干转方法，15v，45min，将目的蛋白转印到硝酸纤维素膜(NC)上；采用5％脱脂奶粉封闭3h，一抗4℃过夜孵育；然后用TBST洗三次，每次15分钟；再孵育二抗，室温3小时；最后用ECL发光液显影，用TanonGis软件进行灰度值分析。其中，所述一抗为GAPDH(ab181603，1∶10000，36kDa；Abcam)，PSMA5(1∶5000，27KD；cellsignaling)。其中，所述二抗为Goatanti-RabbitIgG-H&L(ab6721，1∶3000；Abcam)。本专利技术具有以下有益效果：构建了PSMA5基因RNA干扰载体，转染奶牛乳腺上皮细胞(MAC-T)，并利用实时荧光定量PCR及westernblotting的方法分别在mRNA和蛋白水平检测PSMA5基因的表达情况，为进一步揭示PSMA5在乳腺的CLA内源性合成中的作用提供技术依据。附图说明图1为本专利技术实施例中重组RNA干扰载体测序图。图2为本专利技术实施例中PSMA5mRNA水平相对表达量，图中，A：细胞转染48h后PSMA5mRNA水平相对表达量B：分化4d后PSMA5mRNA水平相对表达量。图3为本专利技术实施例中PSMA5蛋白水平相对表达量。具体实施方式为了使本文档来自技高网...
【技术保护点】
牛PSMA5基因RNA干扰载体的构建与筛选及在奶牛乳腺上皮细胞中的表达，其特征在于，包括如下步骤：S1、在NCBI上查询牛PSMA5基因的CDS区序列，根据shRNA的设计原则在invitrogen的shRNA在线设计网站上设计PSMA5基因的shRNA靶序列；S2、选择4条合适的shRNA靶序列以及一条阴性对照序列，根据pLVX‑shRNA2‑puro质粒的酶切位点以及shRNA的设计原则在选择的shRNA靶序列上加上酶切位点、茎环结构和终止转录的序列，送到华大基因合成；S3、将正义链(100uM)5ul；反义链(100uM)5ul；10X退火缓冲液5ul；ddH20 35ul混合后置于水浴锅中，95℃加热5min后，关闭水浴锅自然降温至30℃以下，取样电泳，切胶回收退火产物，置于‑20℃备用；S4、用EcoRl、BamHl限制性内切酶双酶切pLVX‑shRNA2‑puro空质粒，37℃，4h，酶切体系如下：pLVX‑shRNA2‑puro空质粒20ul；EcoRl限制性内切酶1ul；BamHl限制性内切酶1ul；10X CutSmart缓冲液5ul；ddH20 23ul；S5、将所得退火产物与所得的双酶切的pLVX‑shRNA2‑puro空质粒用T4 DNA连接酶连接，16℃，过夜；S6、将测序正确的菌液进行无内毒素质粒大提，提取的质粒以备转染细胞；将MAC‑T细胞培养到汇合度为80％时，传代到6孔板中，24h后进行细胞转染，按照lipofectamineTM2000说明操作，转染48h后检测荧光；S7、收集转染后48h的细胞，提取RNA，‑80℃备用，筛选出最有效的shRNA重新转染细胞，待细胞汇合度大于90％后，更换分化培养基；分化培养4days后提取RNA和总蛋白，‑80℃备用；S8、在NBCI上找到牛的内参基因β‑actin和PSMA5的CDS区序列，用primer premier5软件设计引物，送华大基因合成，引物序列如下：β‑actin‑F：5’CAGCAAGCAGGAGTACGATG3’；β‑actin‑R：5’AGCCATGCCAATCTCATCTC3’；PSMA5‑F：5’CCTTCGGAGTAGCACTGTTAT3’；PSMA5‑R：5’CTCTGAGCACCCTCTGAAGC3’；反应体系如下：2X FastStart Universal SYBR Green Master(Rox)10ul；引物(上)0.4ul；引物(下)0.4ul；模板cDNA 1ul；ddH20 8.2ul；S9、按照如下程序进行实时荧光定量PCR：条件如下首先在95℃运行2min，之后40个PCR循环(95℃10s；60℃34s)；之后95℃1min；55℃30s；95℃30s；S10、采用2‑ΔΔct法计算荧光定量结果，在4条设计的shRNA序列中选取干扰效率最高的一条，再转染细胞，进行后续的Western blotting检测。...
【技术特征摘要】
1.牛PSMA5基因RNA干扰载体的构建与筛选及在奶牛乳腺上皮细胞中的
表达，其特征在于，包括如下步骤：
S1、在NCBI上查询牛PSMA5基因的CDS区序列，根据shRNA的设计原则在
invitrogen的shRNA在线设计网站上设计PSMA5基因的shRNA靶序列；
S2、选择4条合适的shRNA靶序列以及一条阴性对照序列，根据
pLVX-shRNA2-puro质粒的酶切位点以及shRNA的设计原则在选择的shRNA靶序
列上加上酶切位点、茎环结构和终止转录的序列，送到华大基因合成；
S3、将正义链(100uM)5ul；反义链(100uM)5ul；10X退火缓冲液5ul；
ddH2035ul混合后置于水浴锅中，95℃加热5min后，关闭水浴锅自然降温
至30℃以下，取样电泳，切胶回收退火产物，置于-20℃备用；
S4、用EcoRl、BamHl限制性内切酶双酶切pLVX-shRNA2-puro空质粒，37℃，
4h，酶切体系如下：pLVX-shRNA2-puro空质粒20ul；EcoRl限制性内切酶1
ul；BamHl限制性内切酶1ul；10XCutSmart缓冲液5ul；ddH2023ul；
S5、将所得退火产物与所得的双酶切的pLVX-shRNA2-puro空质粒用T4DNA
连接酶连接，16℃，过夜；
S6、将测序正确的菌液进行无内毒素质粒大提，提取的质粒以备转染细胞；
将MAC-T细胞培养到汇合度为80％时，传代到6孔板中，24h后进行细胞转染，
按照lipofectamineTM2000说明操作，转染48h后检测荧光；
S7、收集转染后48h的细胞，提取RNA，-80℃备用，筛选出最有效的shRNA
重新转染细胞，待细胞汇合度大于90％后，更换分化培养基；分化培养4days
后提取RNA和总蛋白，-80℃备用；
S8、在NBCI上找到牛的内参基因β-actin和PSMA5的CDS区序列，用primer
premier5软件设计引物，送华大基因合成，引物序列如下：
β-actin-F：5’CAGCAAGCAGGAGTACGATG3’；
β-actin-R：5’AGCCATGCCAATCTCATCTC3’；
PSMA5-F：5’CCTTCGGAGTAGCACTGTTAT3’...
【专利技术属性】
技术研发人员：金永成，迟玉杨，张晶，沈景林，周长海，牛淑玲，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：吉林;22
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