用于从混合物富集突变核酸的方法技术

由于非常过量的野生型DNA的同时存在，从生物样品检测罕见体细胞突变的存在经常是挑战性的。本发明专利技术描述了通过排除可扩增的野生型DNA而允许富集突变型DNA的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】专利

本专利技术涉及核酸化学和核酸扩增的领域。具体地，本专利技术涉及使用可以检测核酸中的碱基对错配的化合物和方法富集低丰度突变型目标核酸。
专利技术背景
已知大多数人遗传疾病和癌症由核基因中的突变造成。通常，认为突变是遗传基因座处的特定多态变体。所述突变可以是单个核苷酸差异，经常被称作点突变。在细胞和组织水平，在特定遗传基因座处的多态性可以导致显著改变的细胞行为。然而，因为甚至相对小的细胞或组织样品可以含有数百万或数十亿含有该特定遗传基因座的DNA分子，在遗传基因座处的多态变体的范围和频率的表示需要检测潜在地以非常低频率存在的等位基因。在大多数情况下，由于非常过量的野生型DNA的同时存在，来自生物样品的罕见突变的存在的检测提出了巨大的挑战。
因此，本领域中需要选择性和准确地富集低拷贝突变型DNA的方法，使得它们的存在在进行扩增反应(诸如PCR)之后可以是可检测的。
专利技术概述
本专利技术涉及用于富集样品中的低丰度等位基因(例如突变型DNA)的方法，所述样品允许随后检测这样的等位基因。在第一方面，本专利技术涉及从样品富集核酸混合物中的目标核酸的变体的方法，所述目标核酸以两种变体序列的形式存在，其中所述变体在单个核苷酸位置处不同，所述方法包括，提供包括所述目标核酸的样品，其中待富集的变体在大量过量的其它变体中以低丰度存在于所述样品中；以对于所述目标核酸摩尔过量的浓度提供与所述目标核酸的一条链互补的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸与亲和标记附接且在所述单个核苷酸位置处与待富集的变体完全匹配且在所述单个核苷酸位置处与其它变体具有错配；提供适合于所述寡核苷酸与所述目标核酸杂交的条件，以生成由所述寡核苷酸和所述目标核酸的任一种变体的一条链组成的双链体多核苷酸；使所述双链体多核苷酸与优先仅结合至含有错配的双链体多核苷酸的错配嵌入化合物接触，其中所述化合物进一步能够用光催化在所述错配位点处切割所述双链体多核苷酸的一条链；使所述双链体多核苷酸经受光，导致产生切割和未切割的双链体多核苷酸两者；将切割和未切割的双链体多核苷酸两者应用于亲和基质，所述亲和基质识别并结合至所述寡核苷酸上的亲和标记；提供仅切割的双链体多核苷酸变性的条件并从所述亲和基质移除变性的单链；且在使未切割的多核苷酸双链体变性的条件下提供缓冲液；并收集含有富集的目标核酸的变体的一条链的缓冲液。在一个实施方案中，所述错配嵌入化合物是Rh(bpy)2(chrysi)3+或Rh(bpy)2(phzi)3+或它们各自的类似物。在另一个实施方案中，本专利技术涉及扩增并检测富集的目标核酸的变体的进一步步骤。
在第二方面，本专利技术涉及用于从样品检测核酸混合物中的目标核酸的突变型等位基因的方法，其中所述突变型等位基因与野生型等位基因在单个核苷酸位置处不同，并且在大量过量的野生型等位基因间以低丰度存在于样品中，所述方法包括，富集所述样品中的突变型等位基因，其中所述富集通过以下进行：以对于所述目标核酸摩尔过量的浓度提供与所述目标核酸的一条链互补的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸与亲和标记附接且在所述单个核苷酸位置处与所述突变型等位基因完全匹配且在所述单个核苷酸位置处与野生型等位基因具有错配；提供适合于所述寡核苷酸与所述目标核酸杂交的条件，以生成由所述寡核苷酸和所述突变型等位基因或所述野生型等位基因的一条链组成的双链体多核苷酸；使所述双链体多核苷酸与优先仅结合至含有错配的双链体多核苷酸的错配嵌入化合物接触，其中所述化合物进一步能够用光催化在所述错配位点处切割所述双链体多核苷酸的一条链；使所述双链体多核苷酸经受光，导致产生切割和未切割的双链体多核苷酸两者；将切割和未切割的双链体多核苷酸两者应用于亲和基质，所述亲和基质识别并结合至所述寡核苷酸上的亲和标记；提供仅切割的双链体多核苷酸变性的条件并从所述亲和基质移除变性的所述野生型等位基因的单链；在使未切割的多核苷酸双链体变性的条件下提供缓冲液；并收集含有富集的目标核酸的突变型等位基因的一条链的缓冲液；扩增所述富集的突变型等位基因；且检测富集的扩增的突变型等位基因的产物或从富集的扩增的突变型等位基因生成的信号。在一个实施方案中，所述错配嵌入化合物是Rh(bpy)2(chrysi)3+或Rh(bpy)2(phzi)3+或它们各自的类似物。
附图简述图1显示了基于铑的嵌入剂Rh(bpy)2(chrysi)3+(左)和Rh(bpy)2(phzi)3+(右)的结构，其中N表示氮，Rh表示铑，且R1、R2和R3独立地选自氢、烷基、芳基、固体支持物和附接亲和标记的接头。
图2显示本专利技术的用于富集突变型等位基因的单链的方法的图示。
专利技术详述
定义除非另外定义，在本文中使用的所有技术和科学术语具有本专利技术所属领域的技术人员通常理解的含义。以下参考文献给技术人员提供了在本专利技术中使用的许多术语的一般定义：Singleton等人,DictionaryofMicrobiologyandMolecularBiology(1994年第2版);TheCambridgeDictionaryofScienceandTechnology(Walker编,1988);TheGlossaryofGenetics,第5版,R.Rieger等人(编),SpringerVerlag(1991)；和Hale&Marham,TheHarperCollinsDictionaryofBiology(1991)。本文中使用的以下术语具有归于它们的含义，除非另有说明。
术语“核酸”是指核苷酸(例如，核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、核苷酸类似物等)的聚合物，并且包含脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、DNA-RNA杂交物、寡核苷酸、多核苷酸、适体、肽核酸(PNA)、PNA-DNA缀合物、PNA-RNA缀合物等，其包含以直链或支链方式共价连接在一起的核苷酸。核酸通常是单链的或双链的，并且通常含有磷酸二酯键，尽管在某些情况下，包括可以具有替代主链的核酸类似物，包括、例如，磷酰胺(Beaucage等人(1993)Tetrahedron49(10):1925)；硫代磷酸酯(phosphorothioate)(Mag等人(1991)NucleicAcidsRes.19:1437；和美国专利号5,644,048)、二硫代磷酸酯(Briu等人(1989)J.Am.Chem.Soc.111:2321)、O-甲基亚磷酰胺(O-methylphophoroamidite)连接(参见Eckstein,OligonucleotidesandAnalogues:APracticalApproach,OxfordUniversityPress(1992))和肽核酸主链和连接(参见，Egholm(1992)J.Am.Chem.Soc.114:1895)。其它类似物核酸包括具有带正电荷主链的类似物核酸(Denpcy等人(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA92:6097)；具有非离子主链(美国专利号5,386,023、5,637,684、5,602,240、5,216,141和4,469,863)和非核糖主链的类似物核酸，包括在美国专利号5,235,033和5,034,506中描述的类似物核酸。含本文档来自技高网...

【技术保护点】
从样品富集核酸混合物中的目标核酸的变体的方法，所述目标核酸以两种变体序列的形式存在，其中所述变体在单个核苷酸位置处不同，所述方法包括：提供包括所述目标核酸的样品，其中待富集的变体在大量过量的其它变体中以低丰度存在于所述样品中；以对于所述目标核酸摩尔过量的浓度提供与所述目标核酸的一条链互补的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸与亲和标记附接且在所述单个核苷酸位置处与待富集的变体完全匹配且在所述单个核苷酸位置处与其它变体具有错配；提供适合于所述寡核苷酸与所述目标核酸杂交的条件，以生成由所述寡核苷酸和所述目标核酸的任一种变体的一条链组成的双链体多核苷酸；使所述双链体多核苷酸与优先仅结合至含有错配的双链体多核苷酸的错配嵌入化合物接触，其中所述化合物进一步能够用光催化在所述错配位点处切割所述双链体多核苷酸的一条链；使所述双链体多核苷酸经受光，导致产生切割和未切割的双链体多核苷酸两者；将切割和未切割的双链体多核苷酸两者应用于亲和基质，所述亲和基质识别并结合至所述寡核苷酸上的亲和标记；提供仅切割的双链体多核苷酸变性的条件并从所述亲和基质移除变性的单链；且在使未切割的多核苷酸双链体变性的条件下提供缓冲液；并收集含有富集的目标核酸的变体的一条链的缓冲液。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.11.27 US 61/9095871.从样品富集核酸混合物中的目标核酸的变体的方法，所述目标核酸以两种变体序列的形式存在，其中所述变体在单个核苷酸位置处不同，所述方法包括：
提供包括所述目标核酸的样品，其中待富集的变体在大量过量的其它变体中以低丰度存在于所述样品中；
以对于所述目标核酸摩尔过量的浓度提供与所述目标核酸的一条链互补的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸与亲和标记附接且在所述单个核苷酸位置处与待富集的变体完全匹配且在所述单个核苷酸位置处与其它变体具有错配；
提供适合于所述寡核苷酸与所述目标核酸杂交的条件，以生成由所述寡核苷酸和所述目标核酸的任一种变体的一条链组成的双链体多核苷酸；
使所述双链体多核苷酸与优先仅结合至含有错配的双链体多核苷酸的错配嵌入化合物接触，其中所述化合物进一步能够用光催化在所述错配位点处切割所述双链体多核苷酸的一条链；
使所述双链体多核苷酸经受光，导致产生切割和未切割的双链体多核苷酸两者；
将切割和未切割的双链体多核苷酸两者应用于亲和基质，所述亲和基质识别并结合至所述寡核苷酸上的亲和标记；
提供仅切割的双链体多核苷酸变性的条件并从所述亲和基质移除变性的单链；且
在使未切割的多核苷酸双链体变性的条件下提供缓冲液；并收集含有富集的目标核酸的变体的一条链的缓冲液。
2.权利要求1的方法，其中所述错配嵌入化合物是Rh(bpy)2(chrysi)3+、Rh(bpy)2(phzi)3+或它们的类似物，如图1中所示。
3.权利要求2的方法，其中待富集的变体是突变型等位基因，且其它变体是野生型等位基因。
4.权利要求3的方法，其中所述突变型等位基因是突变型EGFR等位基因，且所述野生型等位基因是野生型EGFR等位基因。
5.权利要求3或4的方法，其进一步包括扩增和检测所述突变型等位基因的步骤。
6.用于从样品检测核酸混合物中的目标核酸的突变型等位基因的方法，其中所述突变型等位基因与野生型等位基因在单个核苷酸位置处不同，并且在大量过量的野生型等位基因中以低丰度存在于样品中，所述方法包括：
富集所述样品中的突变型等位基因，其中所述富集通过以下进行：
以对于所述目标核酸摩尔过量的浓度提供与所述目标核酸的一条链互补的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸与亲和标记附接且在所述单个核苷酸位置处与所述突变型等位基因完全匹配且在所述单个核苷酸位置处与野生型等位基因具有错配；
提供适合于所述寡核苷酸与所述目标核酸杂交的条件，以生成由所述寡核苷酸和所述突变型等位基因或所述野生型等位...

【专利技术属性】
技术研发人员：N舍恩布伦纳，A古普塔，K延森，
申请(专利权)人：豪夫迈·罗氏有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH