去除残留细胞培养杂质制造技术

本发明专利技术公开了用于从蛋白质制备物中去除残留杂质的方法。这类方法包括在非沉淀条件下向包含感兴趣的蛋白质和细胞污染物的溶液中加入阴离子去污剂并将该溶液通过离子交换柱。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请本国际专利申请要求2013年11月15日提交的美国临时申请61/904,747和2013年12月20日提交的欧洲申请13199257.0的优先权，其内容在此通过引用全文纳入本文。专利
本专利技术涉及在宿主细胞中生产蛋白质及其改善的纯化方法。
技术介绍
已经预先描述了用于在细胞培养物中生产疫苗和其它生物制剂的各种方法。如果使用连续细胞系来进行生产，则存在细胞系的残留DNA可能有致癌性的风险。因此需要从感兴趣的治疗性蛋白质中破坏并去除残留DNA。对于病毒疫苗，FDA最近推荐低于10ng/剂的DNA的量和低于200个碱基对的片段尺寸(《工业指南：用于生产针对感染性适应症的病毒疫苗的细胞基质和其它生物材料的表征和资质》(GuidanceofIndustry.CharacterizationandQualificationofCellSubstratesandotherBiologicalMaterialsUsedintheProductionofViralVaccinesforInfectionsDiseaseIndications).FDA/CBER2010年2月；可从以下下载：http://www.fda.gov/downloads/biologicsbloodvaccines/guidancecomplianceregulatoryinformation/guidances/vaccines/ucm202439.pdf)。<br>已经描述了几种用于从细胞培养衍生的疫苗中去除残留DNA的方法。美国专利5,948,410描述了用于从细胞培养物中生产流感疫苗的方法，其中DNA酶处理与使用CTAB的裂解步骤结合。WO2007/052163描述了用于从细胞培养物中生产流感疫苗的方法，其中使用β-丙内酯(BPL)来灭活病毒并降解残留DNA。然后，例如，通过用CTAB处理来裂解病毒。然后从病毒制备物中去除片段化的DNA。无论如何，仍然需要进一步改进从流感病毒制备物或从连续细胞系中产生的其它感兴趣产物中去除残留细胞DNA。US2012-0101262中已经公开了辛酸与离子交换色谱联用来从细胞培养物中产生的抗体中去除细胞DNA。然而，US2012-0101262需要在诱导残留DNA沉淀并污染蛋白质(具体是低pH下)的条件下使用辛酸。然后，可分离沉淀物和感兴趣的蛋白质，并且后者通过离子交换色谱进一步纯化。本领域已经描述了使用辛酸或辛酸盐从细胞培养物中去除杂质和聚集体的多种其它方法。Steinbuch(Steinbuch,M.等，Arch.Biochem.Biophys.134:279-94(1969))描述了通过对其中无包膜和包膜病毒的辛酸盐沉淀从人血浆中回收IgG。美国专利7,553,938描述了通过在pH4.6至约4.95下加入辛酸根或庚酸根离子从起始溶液中纯化抗体并且将该溶液过滤通过至少一种阴离子交换树脂。美国专利5,886,154描述了从人血浆中纯化抗体的过程，包括在pH3.8至4.5下悬浮抗体，之后在pH5.0至5.2下加入辛酸以沉淀污染蛋白质和脂质，同时抗体保留在溶液中。抗体纯化中采用辛酸，因为短脂肪酸与α球蛋白和β球蛋白在酸性pH下形成不溶性复合物，其中γ球蛋白不易于沉淀(Chanutin等，1960)。因此，可易于分离γ球蛋白。但是，这些公开都没有教导或启示使用阴离子去污剂来在防止本文所述的沉淀的条件下从病毒蛋白质中去除残留DNA。
技术实现思路
本专利技术涉及制备蛋白质及其改善的纯化方法。具体地，本专利技术提供了从合适宿主(例如，宿主细胞)中产生的蛋白质产物中去除细胞污染如残留核酸的方法。因此，本专利技术也包括通过这类方法制备的相关组合物。本专利技术因此包括增加从细胞培养物中产生的生物产品的产率、纯度和/或安全性的方法。通过本专利技术的方法制备的生物产品可包括，但不限于：生物药物、蛋白质、多糖、病毒抗原和抗体。在一个具体方面中，本专利技术提供了基本没有残留DNA的生物产品。专利技术人已经惊讶地发现通过向包含蛋白质和细胞DNA的溶液中加入阴离子去污剂，之后进行包括离子交换基质的纯化步骤显著改善了对包含源自细胞培养物的蛋白质和DNA的样品的纯化。待解决的问题可能涉及在带正电的离子交换基质中从感兴趣的蛋白质中分离带负电的DNA杂质的低效。可以假定次级相互作用在减少阴离子交换色谱吸附带负电的DNA杂质的能力上起到作用。本专利技术现在通过用阴离子去污剂溶液接触残留DNA并通过在阴离子交换基质上吸附来处理残留DNA实现了富集的产物及其增加的产率。专利技术人意外地发现本专利技术也去除了流感病毒核蛋白。通过本专利技术实现的污染物的高效去除能有更高的产品产率，因为可增加孵育和感染次数使得可以得到更高量的感兴趣蛋白质。本专利技术也包括以下认识，即如果在阴离子去污剂如脂肪酸去污剂(例如，辛酸钠)存在下通过离子交换色谱纯化病毒制备物，可实现从细胞培养物中产生的流感病毒中特别有效地去除残留DNA。令人惊讶地，专利技术人也已经发现本文所述的方法基本去除流感病毒核蛋白(NP)。优选地，如果需要去除NP，本专利技术并不限于源自细胞培养物的流感病毒，但也可应用于在鸡蛋中产生的流感病毒。与本领域所述的方法不同(参见上述“背景”)，本专利技术在不沉淀感兴趣的蛋白质或DNA的条件下采用阴离子去污剂。根据本专利技术，通过阴离子交换色谱从污染DNA/蛋白质中分离来制备感兴趣的蛋白质。通过使用本文所述的方法，可显著降低样品中杂质(例如，残留DNA)的量。可使用本专利技术来从含在宿主细胞，如细胞培养物中产生的一种或多种感兴趣蛋白质的任意样品中去除残留细胞DNA。因此，本专利技术提供了一种用于从包含在宿主细胞，如细胞培养物中产生的感兴趣蛋白质的样品中去除残留细胞DNA的方法，包括在非沉淀条件下向包含感兴趣的蛋白质的溶液中添加阴离子去污剂并且将该溶液通过离子交换基质以去除残留细胞DNA。本专利技术的方法并不受到特定感兴趣蛋白的限制。可按照本专利技术纯化的蛋白质的非限制性示例包括，但不限于：治疗性蛋白质、抗原(例如，免疫原性蛋白质)、抗体或其片段。根据本专利技术，可经过本专利技术提供的方法的合适起始物质可以是包含感兴趣蛋白质的溶液。该溶液可以是粗制细胞或组织制备物、部分纯化的制备物、细胞在其中生长的培养基、或细胞培养上清等，但可能含有需要去除的残留细胞污染物。感兴趣的蛋白质可在合适的宿主细胞系统中生长并且可通过本领域已知的常规分离技术从细胞杂质中纯化或澄清。任选地，可在将本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从包含感兴趣的蛋白质的样品中去除残留细胞DNA的方法，所述方法包括以下步骤：a.在非沉淀条件下向包含感兴趣的蛋白质的溶液加入阴离子去污剂；和b.将所述溶液通过离子交换基质，从中所述残留细胞DNA结合至离子交换树脂，以获得包含所述感兴趣的蛋白质的洗脱液，其中所述洗脱液基本没有细胞DNA。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.11.15 US 61/904,7471.一种从包含感兴趣的蛋白质的样品中去除残留细胞DNA的方法，
所述方法包括以下步骤：
a.在非沉淀条件下向包含感兴趣的蛋白质的溶液加入阴离子去污剂；
和
b.将所述溶液通过离子交换基质，从中所述残留细胞DNA结合至离
子交换树脂，以获得包含所述感兴趣的蛋白质的洗脱液，其中所述洗脱液
基本没有细胞DNA。
2.一种从包含病毒蛋白质的样品中去除残留细胞DNA的方法，所述
方法包括以下步骤：
a.提供包含宿主细胞系统中生长的病毒的样品，其中所述病毒表达感
兴趣的病毒蛋白质；
b.裂解所述病毒；
c.在非沉淀条件下向包含所述病毒蛋白质的溶液加入阴离子去污剂；
和
d.将所述溶液通过离子交换基质，从中残留细胞DNA结合至离子交
换树脂，以获得包含所述感兴趣的病毒蛋白质的洗脱液。
3.一种制备流感病毒疫苗组合物的方法，所述组合物包含源自细胞培
养物上增殖的病毒的免疫原性蛋白质，所述方法包括以下步骤：
a.在细胞培养物中生长病毒，
b.在非沉淀条件下向包含所述免疫原性蛋白质的溶液加入脂肪酸去
污剂，和
c.在离子交换基质上处理所述免疫原性蛋白质。
4.一种从包含感兴趣的病毒蛋白质的制备物中去除流感病毒核蛋白
(NP)的方法，所述方法包括以下步骤：
a.裂解从细胞培养物或鸡蛋中衍生的病毒制备物，
b.在非沉淀条件下向所述病毒制备物加入阴离子去污剂，和
c.使所述病毒制备物通过离子交换基质，从中所述核蛋白结合至所述
离子交换基质。
5.如权利要求1-4所述的方法，其特征在于，所述方法还包括澄清步
骤。
6.如权利要求1-4所述的方法，其特征在于，所述方法还包括浓缩步
骤。
7.如权利要求1-4所述的方法，其特征在于，所述方法还包括深度过
滤步骤。
8.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在去污剂
步骤(b)之前的裂解步骤。
9.如权利要求2-4所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在离子
交换步骤之前的灭活步骤。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述裂解步骤包括用
CTAB处理。
11.如前...

【专利技术属性】
技术研发人员：C·诺曼，E·苏达，K·道利斯，R·埃斯提加拉加，P·巴斯泰克，V·耶农，
申请(专利权)人：诺华股份有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH