奶牛精子低温冷冻保存方法技术

一种奶牛精子低温冷冻保存方法，涉及精子保存，尤其是一种对奶牛精子冷冻具有保护作用，能提高冷冻效果的奶牛精子低温冷冻保存方法。该奶牛精子低温冷冻保存方法，其特征在于该保存方法是将奶牛精子放入添加有鸽子蛋卵黄的低温冷冻保存液中进行低温保存，利用鸽子蛋卵黄中含有的低密度脂蛋白对奶牛精子的保护作用，减少奶牛精子复苏后的死亡率。本发明专利技术的奶牛精子低温冷冻保存方法，采用鸽子蛋卵黄进行制备，鸽子卵黄对奶牛精子具有更好的保护效果，在此冷冻保存液下，奶牛冷冻精子复苏运动度、运动度复苏率和精子质膜完整率均高于其他已见报道添加不同物种卵黄的冷冻保存液；采用此种保存液，能提高奶牛精液的冷冻效果，在实践生产中易于推广。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及精子保存，尤其是一种对奶牛精子冷冻具有保护作用，能提高冷冻效果的奶牛精子低温冷冻保存方法。
技术介绍
精子的超低温冷冻保存技术，为家畜品种繁殖和改良，珍惜、濒危动物种质保存、人类不育症治疗等奠定了基础。早在200多年前，人们就知道一些哺乳动物的精子在短暂暴露于稍低温度后仍能存活。自从1951年世界上首次用冷冻并复苏的奶牛精子进行人工授精获得牛犊以来，奶牛精子冷冻技术已非常成熟，应用最为广泛。在奶牛精子冷冻过程中，为了减少冷冻对精子造成的损伤，需要添加一些物质，如卵黄、缓冲剂、糖类物质、抗菌物质、防冻剂及其他物质。在工厂化冻精生产中，卵黄是必不可少的保护物质，目前采用最多的是鸡蛋的蛋黄，但是在冷冻保存后的复苏使用过程中，仍有大量精子死亡，据调查、文献检索以及分析，奶牛精子在冷冻过程中，其效果很稳定，但复苏后依然会有大量精子死亡。
技术实现思路
本专利技术所要解决的就是现有奶牛精子利用鸡蛋蛋黄作为添加剂，虽然冷冻过程稳定，但是复苏后会有大量精子死亡的问题，提供一种对奶牛精子冷冻具有保护作用，能提高冷冻效果的奶牛精子低温冷冻保存液以及保存方法。本专利技术的奶牛精子低温冷冻保存方法，其特征在于该保存方法是将奶牛精子放入添加有鸽子蛋卵黄的低温冷冻保存液中进行低温保存，利用鸽子蛋卵黄中含有的低密度脂蛋白对奶牛精子的保护作用，减少奶牛精子复苏后的死亡率。所述的奶牛精子的低温保存步骤如下：（1）取15-20μL精液放入试管中，然后在试管中加入精液体积量5倍的保存液A进行稀释；（2）将步骤（1）中得到的混合液放入4℃冰浴中放置1小时，然后取与保存液A相同体积量的保存液B，预冷至4℃，分成五等份，分五次加入混合液中，每次加入的时间间隔为6分钟，最后在4℃冰浴放置30分钟；（3）取0.2ml步骤（2）得到的精子混合液装入0.25mL冷冻麦管中，封口后置于液氮表面上方5cm处，冷冻10分钟，然后投入液氮中保存即可。在使用时，将-196℃液氮中保存的精子进行解冻，将麦管取出迅速投入37℃水浴中2分钟，即可使用。所述的保存液A和保存液B中包括柠檬酸钠、青霉素、链霉素、鸽子蛋卵黄、甘油以及Milli-Q水，通过以下步骤制得：（1）鸽子蛋卵黄制备：将鸽子蛋表面清洗消毒后，敲破蛋壳并去除蛋清，用Milli-Q水将完整的卵黄冲洗数遍，将蛋清冲洗干净，然后用吸纸吸干卵黄表面的水分，最后用一次性注射器刺破卵黄膜吸取，得到鸽子蛋卵黄；（2）保存液A制备：在每1000mlMilli-Q水中加入20-30g柠檬酸钠、100ml-300ml鸽子蛋卵黄、60-70mg青霉素以及40-60mg链霉素，混合后以转速7000g进行离心1小时，去除卵黄颗粒，然后取上层清液并调解其pH值至7.0-7.2，得到保存液A；（3）保存液B制备：在步骤（2）中得到的保存液A中加入10-20%的甘油，得到保存液B。所述的Milli-Q水指标为产水量为1.2L/min，电阻率18.2MΩ.cm/25℃.总有机碳＜10ppb，热源＜0.001Eu/ml。对冷冻后复苏的精子质量进行检测：（1）精子的运动度和运动度的复苏率：分别计数鲜精和冷冻精子运动度，取10μL精液加到预热至37℃的血细胞计数板上，在显微镜下计数活动精子的百分率，每次计数200个或以上精子，并至少重复1次；根据精子运动度复苏率=冷冻前精子的运动度/复苏精子运动度×100%进行检测；（2）精子质膜完整率：精子质膜完整率的检测采用荧光染料Hoechst33258染色：先将鲜精或冷冻精液稀释，取出500μL，加入1μLHoechst33258，避光于37℃孵育10min。然后在250g离心5min，洗去多余染料；沉淀的精子用100μL预热的TALP-Hepes洗精液稀释混匀；取10μL制片置荧光显微镜下；质膜破损的精子头部被染成蓝色，质膜完整的精子头部不被染色；计数质膜完整精子占精子总数的百分比，每次至少计数200个精子；（3）数据统计分析：精子运动度和质膜完整率等百分比数据用平均值±标准差表示，百分数值进行平方根的反正弦转换，然后通过单因素方差分析和最小显著差数法比较数据间的显著性差异，其中p<0.05视为存在显著性差异；将改进的奶牛精子超低温冷冻保存液冷冻复苏精子与现有冷冻保存液冷冻复苏精子进行精子的运动度和运动度的复苏率、精子质膜完整率的指标测试和对比分析，对比结果见下表：鲜精运动度/%复苏精子运动度/%运动度复苏率/%精子质膜完整率/%现有奶牛精子超低温冷冻保存液77.63±4.4648.87±4.56a62.71±2.97a50.53±4.26a改进奶牛精子超低温冷冻保存液77.63±4.4666.15±3.22b84..58±3.05b71.45±4.13b从上表可以看出，通过改进的奶牛精子超低温冷冻保存液冷冻复苏精子的精子运动度、运动度复苏率、精子质膜完整率显著高于现有冷冻保存液冷冻复苏精子，说明使用本试验冷冻保存液对奶牛精子具有更好的抗冻、抗氧化效果。本专利技术的奶牛精子低温冷冻保存方法，采用鸽子蛋卵黄进行制备，鸽子卵黄对奶牛精子具有更好的保护效果，在此冷冻保存液下，奶牛冷冻精子复苏运动度、运动度复苏率和精子质膜完整率均高于其他已见报道添加不同物种卵黄的冷冻保存液；采用此种保存液，能提高奶牛精液的冷冻效果，在实践生产中易于推广。具体实施方式实施例1：一种奶牛精子低温冷冻保存方法，将奶牛精子放入添加有鸽子蛋卵黄的低温冷冻保存液中进行低温保存，利用鸽子蛋卵黄中含有的低密度脂蛋白对奶牛精子的保护作用，减少奶牛精子复苏后的死亡率；具体低温保存步骤如下：（1）取15μL精液放入试管中，然后在试管中加入75μL的保存液A进行稀释；（2）将步骤（1）中得到的混合液放入4℃冰浴中放置1小时，然后取75μL保存液B，预冷至4℃，分成五等份，每份15μL，分五次加入混合液中，每次加入的时间间隔为6分钟，最后在4℃冰浴放置30分钟；（3）取0.2ml步骤（2）得到的精子混合液装入0.25mL冷冻麦管中，封口后置于液氮表面上方5cm处，冷冻10分钟，然后投入液氮中保存即可。在使用时，将-196℃液氮中保存的精子进行解冻，将麦管取出迅速投入37℃水浴中2分钟，即可使用。该保存液A和保存液B中包括柠檬酸钠、青霉素、链霉素、鸽子蛋卵黄、甘油以及Milli-Q水，通过以下步骤制得：（1）鸽子蛋卵黄制备：将鸽子蛋表面清洗消毒后，敲破蛋壳并去除蛋清，用Milli-Q水将完整的卵黄冲洗数遍，将蛋清冲洗干净，然后用吸纸吸干卵黄表面的水分，最后用一次性注射器刺破卵黄膜吸取，得到鸽子蛋卵黄；（2）保存液A制备：在每1000mlMilli-Q水中加入20柠檬酸钠、100ml鸽子蛋卵黄、60mg青霉素以及40mg链霉素，混合后以转速7000g进行离心1小时，去除卵黄颗粒，然后取上层清液并调解其pH值至7.0-7.2，得到保存液A；（本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种奶牛精子低温冷冻保存方法，其特征在于该保存方法是将奶牛精子放入添加有鸽子蛋卵黄的低温冷冻保存液中进行低温保存，利用鸽子蛋卵黄中含有的低密度脂蛋白对奶牛精子的保护作用，减少奶牛精子复苏后的死亡率。

【技术特征摘要】
1.一种奶牛精子低温冷冻保存方法，其特征在于该保存方法是将奶牛精子放入添加有鸽子蛋卵黄的低温冷冻保存液中进行低温保存，利用鸽子蛋卵黄中含有的低密度脂蛋白对奶牛精子的保护作用，减少奶牛精子复苏后的死亡率。
2.如权利要求1所述的奶牛精子低温冷冻保存方法，其特征在于所述的奶牛精子的低温保存步骤如下：
（1）取15-20μL精液放入试管中，然后在试管中加入精液体积量5倍的保存液A进行稀释；
（2）将步骤（1）中得到的混合液放入4℃冰浴中放置1小时，然后取与保存液A相同体积量的保存液B，预冷至4℃，分成五等份，分五次加入混合液中，每次加入的时间间隔为6分钟，最后在4℃冰浴放置30分钟；
（3）取0.2ml步骤（2）得到的精子混合液装入0.25mL冷冻麦管中，封口后置于液氮表面上方5cm处，冷冻10分钟，然后投入液氮中保存即可。
3.如权利要求2所述的奶牛精子低温冷冻保存方法，其特征在于所述的保存液A和保存液B中包括柠檬酸钠、青霉素、链霉...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏雷，苏宇飞，王姝瑭，
申请(专利权)人：云南中科胚胎工程生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：云南;53