一种舒伯特气单胞菌特异性引物及其在大菱鲆养殖过程中的应用制造技术

本发明专利技术涉及一种舒伯特气单胞菌特异性引物及其在大菱鲆养殖过程中的应用。本发明专利技术设计的舒伯特气单胞菌特异性引物由上游引物F：GGGCCCGTTATGACCAGTTT和下游引物R：AGGAGTGATCTTGAGCTTGACC构成。本发明专利技术设计的舒伯特气单胞菌特异性引物，能有效从各常见致病菌株中区分出舒伯特气单胞菌，表现出很强的特异性和灵敏性。本发明专利技术所提供的在大菱鲆养殖过程中舒伯特气单胞菌的PCR检测方法，使得养殖过程中舒伯特气单胞菌的检测更为简便。本发明专利技术方法的确立为今后大菱鲆养殖过程中高发致病菌的检测和分析提供了必要的理论依据和完善的方法体系，同时为促进我国养殖产业的规模化健康发展奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于病原微生物检测领域，具体涉及一种大菱鲆养殖过程中常见的致病菌：舒伯特气单胞菌(Aeromonasschubertii)的PCR检测方法。
技术介绍
有“多宝鱼”之称的大菱鲆已被引进我国长达10年之久，凭借其优良的苗种，先进的创新模式和工业化养殖的潮流，逐渐成为全国引人注目的重要养鱼工业。这一全新产业的发展，对我国的水产经济拉动均有很大作用，并为我国北方沿海城市工业化养鱼的纵向发展奠定了雄厚的理论和实践基础。然而随着养殖规模的快速增长，养殖密度的增加，以及水体环境的恶化，一系列的疾病也随之而来。近年来在大菱鲆养殖过程中细菌性疾病的急剧爆发严重影响并制约了我国大菱鲆养殖产业的健康发展，给养殖户带来了巨大的经济损失。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种对舒伯特气单胞菌具有特异性强且灵敏性高的特异性引物。本专利技术的另一目的是提供一种在大菱鲆养殖过程中，可快速鉴定致病源，为养殖户挽回经济损失的大菱鲆养殖过程中舒伯特气单胞菌的PCR检测方法。本专利技术采用的技术方案是：一种舒伯特气单胞菌特异性引物，所述的舒伯特气单胞菌特异性引物由上游引物F和下游引物R构成；所述的上游引物F的序列为：GGGCCCGTTATGACCAGTTT；所述的下游引物R的序列为：AGGAGTGATCTTGAGCTTGACC。优选的，上述的一种舒伯特气单胞菌特异性引物，所述的舒伯特气单胞菌是Aeromonasschubertii。一种大菱鲆养殖过程中舒伯特气单胞菌的PCR检测方法，方法如下：1)提取大菱鲆病灶部位细菌的总DNA；2)以所提取的DNA为模板，采用上述的舒伯特气单胞菌特异性引物，进行PCR扩增；3)根据PCR扩增产物的琼脂糖凝胶呈像结果判断大菱鲆是否被舒伯特气单胞菌感染；如果琼脂糖凝胶呈现结果有704bp条带产生，则大菱鲆被舒伯特气单胞菌感染，否则没有被感染。上述的一种大菱鲆养殖过程中舒伯特气单胞菌的PCR检测方法：PCR反应条件：第一阶段：94℃1min；第二阶段：94℃30s，60℃1min，72℃30s；30循环；第三阶段：72℃2min；第四阶段：4℃保存。本专利技术的有益效果是：1.本专利技术，设计的舒伯特气单胞菌特异性引物，能有效从各常见致病菌株中区分出舒伯特气单胞菌，表现出很强的特异性。2.本专利技术，设计的舒伯特气单胞菌特异性引物，灵敏性高，可有效检出养殖过程中的舒伯特气单胞菌，其最低检测浓度可达到10-4ng/ul。3.本专利技术，所提供的在大菱鲆养殖过程中舒伯特气单胞菌的PCR检测方法，使得养殖过程中舒伯特气单胞菌的检测更为简便。在大菱鲆养殖过程中，一旦有被气单胞菌感染的风险，即能够做到快速鉴定致病源，为养殖户挽回大量损失。本专利技术的检测方法可有效检出大菱鲆养殖过程中的高危致病菌舒伯特气单胞菌，经验证此检测方法特异性强，灵敏度高。该检测方法的确立为今后大菱鲆养殖过程中高发致病菌的检测和分析提供了必要的理论依据和完善的方法体系，不仅为今后大菱鲆养殖产业的健康发展做出了贡献，同时为促进我国养殖产业的规模化健康发展奠定了基础。附图说明图1是舒伯特气单胞菌特异性引物Sc的PCR反应条件优化；其中，M:MarkerDL2000，1-6:退火温度分别为55，56，57，58，59，60℃。图2是舒伯特气单胞菌特异性引物Sc的特异性验证；其中，1.Aeromonasbivalvium；2.Aeromonascaviae；3-4.Aeromonashydrophila；5.Aeromonasjandaei；6.Aeromonassalmonicida；7.Aeromonasschubertii；8.Aeromonassobria；9.Aeromonasveronii；10.Pseudomonasaeruginosa；11.Pseudomonasfragi；12.Pseudomonasgessardii；13.Pseudomonashelmanticensis；14.Pseudomonaskilonensis；15.Pseudomonasmarginalis；16.Vibrioalginolyticus；17.Vibriocyclitrophicus；18.Vibriogigantis；M:MarkerDL2000。图3是舒伯特气单胞菌特异性引物Sc的PCR反应灵敏性验证。其中，M:MarkerDL2000，1-6:模板浓度分别为10，100，10-1，10-2，10-3，10-4ng/ul。具体实施方式下面的实施例将对本专利技术予以进一步的说明，但并不因此而限制本专利技术。实施例1一种舒伯特气单胞菌特异性引物(一)舒伯特气单胞菌特异性引物的设计本实施例针对菌种舒伯特气单胞菌Aeromonasschubertii的dnaJ基因，利用MEGA6软件，设计出对舒伯特气单胞菌Aeromonasschubertii具有特异性强且灵敏性高的一对特异性引物Sc，该舒伯特气单胞菌特异性引物的具体信息如表1所示。表1(二)舒伯特气单胞菌特异性引物最佳PCR反应条件的探索1、待试菌株DNA的提取使用Ezup柱氏基因组DNA抽提试剂盒(细菌)，提取舒伯特气单胞菌(Aeromonasschubertii)菌种的DNA，具体步骤如下：1.1)取1ml过夜培养的含有菌种舒伯特气单胞菌(Aeromonasschubertii)的菌液，加入1.5ml离心管中，室温8000rmp离心1min，弃上清，收集菌体，加入180ulBufferDigestion，再加入20ulProteinaseK溶液，震荡混匀。56℃水浴1h至细胞完全裂解。水浴过程中，每10分钟颠倒混匀一次，促进细胞裂解。1.2)加入200ulBufferBD，充分颠倒混匀。加入BufferBD后，如有沉淀产生，可70℃水浴10分钟。1.3)加入200ul的无水乙醇，充分颠倒混匀。加入无水乙醇后可能产生半透明纤维状悬浮物，不影响DNA的提取和应用。1.4)将吸附柱放入收集管中，用移液器将步骤1.3)获得的溶液和半透明纤维状悬浮物全部加入吸附柱中，静置2min，在12000rmp室温离心1min，倒掉收集管中的废液。1.5)将吸附柱重新放回收集管，加入500ulPWSolution，10000rmp离心30s，倒掉滤液。1.6)将吸附柱重新放回收集管，加入500ulWashSolution，10000rmp离心30s，倒掉滤液。1.7)将吸附柱重本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种舒伯特气单胞菌特异性引物，其特征在于：所述的舒伯特气单胞菌特异性引物由上游引物F和下游引物R构成；所述的上游引物F的序列为：GGGCCCGTTATGACCAGTTT；所述的下游引物R的序列为：AGGAGTGATCTTGAGCTTGACC。

【技术特征摘要】
1.一种舒伯特气单胞菌特异性引物，其特征在于：所述的舒伯特气单胞菌特异性引物由上
游引物F和下游引物R构成；
所述的上游引物F的序列为：GGGCCCGTTATGACCAGTTT；
所述的下游引物R的序列为：AGGAGTGATCTTGAGCTTGACC。
2.根据权利要求1所述的一种舒伯特气单胞菌特异性引物，其特征在于：所述的舒伯特气
单胞菌是Aeromonasschubertii。
3.权利要求1或2所述的舒伯特气单胞菌特异性引物在大菱鲆养殖过程中的应用。
4.一种大菱鲆养殖过程中舒伯特气单胞菌的PCR检测方法，其特征在于方法如下：
1)提取大菱鲆病灶部...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘宏生，顾颖，张新刚，胡桓，艾海新，
申请(专利权)人：辽宁大学，
类型：发明
国别省市：辽宁;21