一种固载溶菌酶的聚多巴胺/氧化石墨烯复合膜的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种固载溶菌酶的聚多巴胺/氧化石墨烯复合膜的制备方法。首先在玻璃等基体表面进行多巴胺的自聚合，再在聚多巴胺膜层上引入不完整的氧化石墨烯膜层，通过控制氧化石墨烯的浓度和浸泡过程中的温度，使得聚多巴胺膜层的部分区域覆有氧化石墨烯，同时在此过程中，氧化石墨烯的含氧官能团部分被聚多巴胺还原，形成部分还原氧化石墨烯膜层；最后在不完整的部分还原氧化石墨烯膜层上固定溶菌酶，制备出固定溶菌酶的聚多巴胺/氧化石墨烯复合膜。本发明专利技术方法简单易操作，通过插入不完整的氧化石墨烯膜层，使复合膜载酶量明显提高，抗菌性能有了显著提高，能实现较长时间的高效率抑菌，在食品安全、医疗卫生等领域具有良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及氧化石墨烯复合材料的制备方法领域，特别是涉及一种具有高抗菌性能和载酶量的聚多巴胺/氧化石墨烯复合膜的制备方法。
技术介绍
抗菌性玻璃或是包装袋作为一种新型生态功能材料，可以被广泛用于医疗、食品安全和公共卫生等领域。现在常见的抗菌玻璃采用在玻璃的制造过程中添加离子化金属如锌、银铜等，或是在玻璃表面涂覆二氧化钛膜，通过二氧化钛的光催化作用起到抗菌作用。但这些杀菌剂仍然对人体具有一定的危害，且释放到环境中会造成二次污染。因此，亟需选择环境更加友好，对人体无害的防污剂。目前，研究较多的是选择蛋白质类的有机抗菌剂，其中，有报道表明，通过聚多巴胺膜层负载溶葡球菌酶，可以使基体表现出较为优异的抗菌性能。但仍然存在一定问题，如蛋白质的活性较短，稳定性较差，因而大大影响了其使用。因此，如何提高蛋白质类杀菌剂的负载量，并延长其抗菌的时间就成为研究热点之一。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术的目的是提供一种负载量高，抗菌时间长的用于固定溶菌酶的聚多巴胺/氧化石墨烯复合膜的制备方法。本专利技术首先在玻璃等基体表面进行多巴胺的自聚合，从而在基体表面包覆一层完整的聚多巴胺膜层；再在聚多巴胺膜层上引入不完整的氧化石墨烯膜层，通过控制氧化石墨烯的浓度，调节浸泡过程中的温度，使得聚多巴胺膜层的部分区域覆有氧化石墨烯，其余部分区域聚多巴胺膜层仍暴露在外，同时在此过程中，氧化石墨烯的含氧官能团部分被聚多巴胺还原，形成部分还原氧化石墨烯膜层；最后在不完整的部分还原氧化石墨烯膜层上固定溶菌酶，制备出固定溶菌酶的聚多巴胺/氧化石墨烯复合膜。本专利技术所采用的氧化石墨烯是hummers法制备出的氧化石墨烯，由于其具有较大的比较面积、较多的含氧官能团，对溶菌酶具有较好的固定作用，且其本身具有良好的抗菌性能，通过聚多巴胺改性后的基体能够较好的固定氧化石墨烯。本专利技术中聚合后形成的聚多巴胺膜层其具有良好的粘附性能，因此可以对溶菌酶和氧化石墨烯进行良好的固定。包覆聚多巴胺/部分还原氧化石墨烯膜层的基体可以大幅度提升溶菌酶固定量，同时延长其抗菌时间。本专利技术包括如下步骤：（1）对玻璃表面进行多巴胺改性将多巴胺或其盐加入到碱性溶液中配制成多巴胺溶液，放入清洗好的基体，室温静置24小时，取出后超声清洗，氮气吹干，以在基体表面包覆一层或多层完整的聚多巴胺膜层；（2）不完整石墨烯衍生物膜层的制备将包覆聚多巴胺膜层的基体放入0.1～0.5mg/mL的氧化石墨烯溶液中，在25～80℃条件下浸泡3小时，形成部分聚多巴胺膜层覆盖有氧化石墨烯的不完整的氧化石墨烯膜层，取出后超声清洗，氮气吹干，由于氧化石墨烯部分被聚多巴胺还原，最后在聚多巴胺膜层上形成不完整的部分还原氧化石墨烯膜层；（3）抗菌蛋白质的固定将pH7.4的PBS溶液中加入抗菌蛋白质，0～4℃条件下搅拌半小时，放入包覆聚多巴胺和不完整的部分还原氧化石墨烯膜层的基体，在4℃条件下浸泡48小时，取出后用PBS冲洗，得到固定溶菌酶的聚多巴胺/氧化石墨烯复合膜。所述的碱性溶液为pH6.5～8.5的Tris溶液或碱性水溶液（如KOH,NaOH），浓度为0.1～0.5mg/mL。所述的抗菌蛋白质为动物溶菌酶、微生物溶菌酶或溶葡球菌酶等具有抗菌杀菌性能的蛋白质。所述动物溶菌酶优选鸡蛋清溶菌酶。所述的基体材质为玻璃、金属或塑料。与现有技术相比，本专利技术具有如下优点：（1）本专利技术将聚多巴胺膜层和不完整的氧化石墨烯膜层结合，制备的聚多巴胺/氧化石墨烯复合膜层，或通过层层组装后制备的复合膜本身具有一定的抗菌作用。（2）本专利技术采用鸡蛋白溶菌酶作为主要的抗菌剂之一，其具有良好的抗菌性能，同时对人体无害，是环境友好的无毒抗菌剂。（3）本专利技术通过插入不完整的氧化石墨烯膜层，使复合膜载酶量明显提高，抗菌性能有了显著提高，同时较现有的同类抗菌剂而言，抗菌时间也有显著提高。附图说明图1是氧化石墨烯（GO）（a），经聚多巴胺/还原氧化石墨烯（PDA/rGO）复合膜改性玻璃表面（b）和经聚多巴胺/还原氧化石墨烯-溶菌酶（PDA/rGO-cLY）复合膜改性的玻璃表面（c）的红外谱图。图2分别是PDA/rGO改性的玻璃表面（a），PDA/rGO改性的玻璃表面的局部放大（b）；PDA/rGO-cLY改性的玻璃表面（c）的扫描电镜照片。图3是经溶菌酶作用后致死的大肠杆菌（a）和经氧化石墨烯作用致死的大肠杆菌（b）扫描电镜照片。图4是培养液中含有经PDA-cLY修饰的玻璃和PDA/rGO-cLY修饰的玻璃的大肠杆菌18小时内与空白组分的生长趋势对比图（a），7小时内的生长趋势对比放大图（b）。图5是经PDA-cLY修饰的玻璃和经PDA/rGO-cLY修饰的玻璃在不同时间点杀菌率对比图。图6是经PDA-cLY改性的玻璃表面（a）和经PDA/rGO-cLY改性的玻璃表面（b）的荧光显微镜照片。图7是分别经0.1mg/mL氧化石墨烯溶液（a）、0.3mg/mL氧化石墨烯溶液（b）和0.5mg/mL氧化石墨烯溶液（c）在50℃条件下浸泡3小时后的PDA/rGO扫描电镜照片。图8是氧化石墨烯溶液为0.3mg/mL条件下，分别在25℃（a），50℃（b）和80℃浸泡3小时后的PDA/rGO扫描电镜照片。具体实施方式下面结合附图以及对比例对本专利技术的实施例进行详细阐述，以使本专利技术的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本专利技术的保护范围做出更为清楚明确的界定。对比例1：对玻璃表面进行PDA-cLY膜层修饰。反应原料是盐酸多巴胺、pH8.5的Tris溶液，鸡蛋白溶菌酶，pH7.4的PBS缓冲液。其中盐酸多巴胺购自于Sigma-Aldrich，鸡蛋白溶菌酶购自于Sigma-Aldrich，活性单位为～100000U/mg，分子量为14.3kDa的单链。（1）对玻璃表面进行多巴胺改性将多巴胺加入到pH8.5的Tris溶液中配制成2mg/mL，放入清洗好的载玻片，室温静置24小时，取出后超声清洗，氮气吹干。（2）抗菌蛋白质的固定将pH7.4的PBS溶液中加入鸡蛋白溶菌酶抗菌类蛋白质，0～4℃条件下搅拌半小时，放入经多巴胺处理过的玻璃片，在4℃条件下浸泡48小时，取出后用PBS冲洗。所制备的抗菌玻璃的抑菌测试如下：（1）菌悬液的配制将大肠杆菌（E.coli）的菌种接入到LB液体培养基中进行活化，将菌液在恒温震荡培养箱中37℃条件下震荡24小时。然后移取活化好的6μL菌种，使其分散在8mLLB液体培养基和PBS缓冲液1:1的溶液中，进行震荡摇匀，放入经过处理的抗菌玻璃，在震荡培养想中37℃条件下震荡培养。（2）定性抑菌测试将培养一段时间后的玻璃片取出后，将细菌固定，利用扫描电镜对其进行观察。（3）定量抑菌测试将培养1小时，3小时，5小时，7小时，13小时和本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种固载溶菌酶的聚多巴胺/氧化石墨烯复合膜的制备方法，其特征在于包括以下步骤：（1）将多巴胺或盐酸多巴胺加入到碱性溶液中配制成多巴胺溶液，放入清洗好的基体，室温静置24小时，取出后超声清洗，氮气吹干，以在基体表面包覆一层或多层完整的聚多巴胺膜层；（2）将包覆聚多巴胺膜层的基体放入氧化石墨烯溶液中，在25℃～80℃条件下浸泡3小时，形成部分聚多巴胺膜层覆盖有氧化石墨烯的不完整的氧化石墨烯膜层，取出后超声清洗，氮气吹干，由于氧化石墨烯部分被聚多巴胺还原，最后在聚多巴胺膜层上形成不完整的部分还原氧化石墨烯膜层；（3）将pH 7.4的PBS溶液中加入抗菌蛋白质，0～4℃条件下搅拌半小时，放入包覆聚多巴胺和不完整的部分还原氧化石墨烯膜层的基体，在4℃条件下浸泡48小时，取出后用PBS冲洗，得到固定溶菌酶的聚多巴胺/氧化石墨烯复合膜。

【技术特征摘要】
1.一种固载溶菌酶的聚多巴胺/氧化石墨烯复合膜的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）将多巴胺或盐酸多巴胺加入到碱性溶液中配制成多巴胺溶液，放入清洗好的基体，室温静置24小时，取出后超声清洗，氮气吹干，以在基体表面包覆一层或多层完整的聚多巴胺膜层；
（2）将包覆聚多巴胺膜层的基体放入氧化石墨烯溶液中，在25℃～80℃条件下浸泡3小时，形成部分聚多巴胺膜层覆盖有氧化石墨烯的不完整的氧化石墨烯膜层，取出后超声清洗，氮气吹干，由于氧化石墨烯部分被聚多巴胺还原，最后在聚多巴胺膜层上形成不完整的部分还原氧化石墨烯膜层；
（3）将pH7.4的PBS溶液中加入抗菌蛋白质，0～4℃条件下搅拌半小时，放入包覆聚多巴胺和不完整的...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈守刚，郝湘平，朱弘政，王龙强，岳龙飞，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：山东;37