核酸靶序列捕获测序文库的制备方法技术

本发明专利技术公开了核酸靶序列捕获测序文库的制备方法；a)根据目标靶序列设计并合成捕获探针A和B溶液；b)在待测DNA或RNA样品中加入探针A溶液，同时加入DNA聚合酶或逆转录酶、dNTP和含Mg2+的缓冲液,延伸探针A；c)再加入链霉亲合素包被的磁珠与探针A结合并洗涤磁珠；d)在含有磁珠的缓冲液中再添加探针B溶液；e)在缓冲液中加入DNA聚合酶、dNTP和含Mg2+的缓冲液延伸探针B；f)洗涤磁珠，通过加热变性使捕获探针B延伸产物从磁珠上解离洗脱下来；g)以捕获探针B延伸产物为模板，用公共引物a和b进行文库PCR扩增，本发明专利技术具有高通量、高特异性、高灵敏度、操作方便、操作成本低、适用范围广。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于核酸测定或检验方法的
，具体是涉及一种基于引物延伸的核酸靶序列捕获测序文库的制备方法。
技术介绍
近年来崛起的新一代高通量DNA测序技术能够并行地对数十亿的DNA片段进行序列测定以及量化，为基础生物医学研究和临床检测提供了一个强大的工具；高通量DNA测序技术的发展也带动了另一项重要的技术的兴起——靶序列捕获测序；靶序列捕获测序是首先通过一些靶向方法提取我们所关心目标基因的DNA片段制备成靶序列测序文库，然后通过高通量测序对其进行分析，例如外显子组(Exome)捕获测序捕获和测定占大约30Mb的全部外显子序列；因为这种测序并不是该物种基因组的首次测序，故称为靶向重测序(Targetedresequencing)；靶向测序技术对于庞大的人类或高等生物的基因组，可以成千上万倍地提高测序的效率，极大地提高样本的通量，使高通量测序更加有效地用于生物医学领域；目前已经发展了多种靶序列捕获策略，主要包括固相芯片捕获、液相探针捕获、分子倒置探针(Molecularinversionprobes)以及乳液PCR(Raindance)等。固相芯片捕获方法是先将靶序列探针(50-70mer)用DNA芯片平行合成技术原位合成在玻璃片上，然后将制备好的测序文库杂交到芯片上；经过条件严谨洗涤，所得到的捕获产物经PCR扩增后测序；通常经过固相芯片捕获，大概50％-60％的序列可以比对到靶序列区域。液相捕获方法是先用原位芯片或常规方法合成超长的靶探针(150-210mer)，然后将其通过T7RNA启动子进行体外转录扩增，产生生物素化的RNA探针；该探针可以在试管中进行杂交和富集，相对固相捕获要方便的多；目前这两个方法已被广泛地应用于连锁分析或关联分析所需的大样本研究。固相芯片捕获和液相捕获是目前最主要的靶序列测序文库制备方法，但是它们在技术上仍然存在一定的局限性；首先，无论是固相芯片捕获还是液相捕获都需要首先将样品DNA通过连接法制备成测序文库，测序文库制备的步骤繁琐难以自动化、耗时耗力。测序文库制备的步骤主要包括：将基因组DNA片段化，将片段化的DNA末端修补齐，在DNA聚合酶的作用下在3’末端加上一个腺苷酸，然后通过DNA连接酶在DNA片段的两端连接含有通用引物序列的接头序列，最后通过一对通用引物扩增DNA片段；然后将制备好的测序文库和靶序列探针杂交，捕获出靶序列。同时，由于测序文库制备的步骤多并且每一步反应后都需要进行纯化，测序文库的制备依赖于起始DNA的量，通常需要100ng以上。然而，目前的研究或诊断常常需要分析极少量的细胞甚至单个细胞或者游离DNA，例如分析循环肿瘤细胞和循环肿瘤DNA需要灵敏度更高的靶向测序文库制备方法。另外，靶序列的捕获探针昂贵，杂交捕获的效率有限(通常50％-60％的捕获效率)；因此该方法的通量低、灵敏度受到一定程度的限制，对于需要高通量的大规模基因组计划或诊疗测序来说不是最适宜的方法。随着基因高通量测序在生命医药领域中迅速发展，其高通量检测的优点被广泛应用，但是目前仍然缺乏一种高通量、高灵敏度、高特异性、低成本的靶序列文库制备方法。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种核酸靶序列捕获测序文库的制备方法，该核酸靶序列捕获测序文库的制备方法通过利用两组捕获探针引物序列，通过两次DNA延伸反应，将样品DNA或RNA中的靶基因序列通过DNA合成复制到探针引物上；然后通过探针引物上的公共测序引物区域，用一对公共引物将复制有靶序列的探针进行PCR扩增，获得靶序列的DNA或RNA测序文库。为了达到上述目的，本专利技术提出了一种核酸靶序列捕获测序文库的制备方法，其步骤如下：a)根据目标靶序列设计并合成两组捕获探针A和B溶液；捕获探针A溶液中捕获探针A(1,2,3…n)的结构从5’到3’端分别是：生物素标记、公共序列P1和与靶序列一侧互补的特异性捕获引物序列a(1,2,3…n)；捕获探针B溶液中捕获探针B(1,2,3…n)的结构从5’到3’端分别是：公共序列P2和与靶序列一侧相同的特异性引物序列b(1,2,3…n)；b)在待测的DNA或RNA样品中首先加入捕获探针A溶液，同时加入DNA延伸所需的DNA聚合酶或逆转录酶、dNTP和含Mg2+的缓冲液，捕获探针A通过其3’端的靶特异性序列a(1,2,3…n)和待测样品中的互补DNA或RNA链杂交，并且探针的3’末端在DNA聚合酶或逆转录酶的作用下以靶序列为模板进行DNA合成，将靶序列复制到捕获探针A上，形成有靶序列的捕获探针A单链，捕获探针A单链的结构为：从5’到3’端分别是生物素标记、公共引物序列P1、特异性引物序列、目标靶序列；c)再加入链霉亲合素包被的磁珠，捕获探针A通过其5’末端的生物素标记结合到链霉亲合素包被的磁珠上，然后分离磁珠，将反应液去除，洗涤磁珠，去除非特异性吸附；将结合有捕获探针A延伸产物的磁珠重新悬浮在缓冲液中；d)在含有磁珠的缓冲液中再添加捕获探针B溶液，捕获探针B通过其3’末端的靶特异性序列与捕获探针A上复制的目标靶序列单链互补区域杂交，然后洗涤磁珠去除非特异性吸附，将磁珠重新悬浮在缓冲液中；E)在缓冲液中加入DNA聚合酶、dNTP和含Mg2+的缓冲液，杂交的捕获探针B的3’末端以捕获探针A延伸产物为模板进行DNA合成，捕获探针B延伸产物的结构为：公共引物序列P2-B组特异性引物序列-目标靶序列-A组特异性引物序列-公共引物序列P1；F)洗涤磁珠，通过加热变性使捕获探针B延伸产物从磁珠上解离洗脱下来；收集捕获探针B延伸产物；G)以捕获探针B延伸产物为模板，用公共引物a和b进行文库PCR扩增；扩增产物即为靶序列捕获测序文库。进一步，所述待测的DNA或RNA样品设置为基因组DNA、线粒体DNA、游离DNA、cDNA、总RNA、信使RNA、长非编码RNA、小RNA和RNA逆转录产物。进一步，针对所有目标靶序列设计并合成两组捕获探针A和B溶液对应的目标靶序列数目设置为不少1个。进一步，1个所述捕获探针A可以对应设置有不少于1个捕获探针B或者1个所述捕获探针B可以对应设置有不少于1个捕获探针A。进一步，所述探针A和探针B上的公共引物区域和特异性引物区域都可以设置有简并性碱基。进一步，所述DNA聚合酶或逆转录酶包括各种DNA聚合酶和逆转录酶，如高保真DNA聚合酶、TaqDNA聚合酶、Klenow聚合酶、II反转录酶、The本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种核酸靶序列捕获测序文库的制备方法，其特征在于：其步骤如下：a)根据目标靶序列设计并合成两组捕获探针A和B溶液；捕获探针A溶液中捕获探针A(1,2,3…n)的结构从5’到3’端分别是：生物素标记、公共序列P1和与靶序列一侧互补的特异性捕获引物序列a(1,2,3…n)；捕获探针B溶液中捕获探针B(1,2,3…n)的结构从5’到3’端分别是：公共序列P2和与靶序列一侧相同的特异性引物序列b(1,2,3…n)；b)在待测的DNA或RNA样品中首先加入捕获探针A溶液，然后同时加入DNA延伸所需的DNA聚合酶或逆转录酶、dNTP和含Mg2+的缓冲液，捕获探针A通过其3’端的靶特异性序列a(1,2,3…n)和待测样品中的互补DNA或RNA链杂交，并且探针的3’末端在DNA聚合酶或逆转录酶的作用下以靶序列为模板进行DNA合成，将靶序列复制到捕获探针A上，形成有靶序列的捕获探针A单链，捕获探针A单链的结构为：从5’到3’端分别是生物素标记，公共引物序列P1，特异性引物序列，目标靶序列；c)再加入链霉亲合素包被的磁珠，捕获探针A通过其5’末端的生物素标记结合到链霉亲合素包被的磁珠上，然后分离磁珠，将反应液去除，洗涤磁珠，去除非特异性吸附；将结合有捕获探针A延伸产物的磁珠重新悬浮在缓冲液中；d)在含有磁珠的缓冲液中再添加捕获探针B溶液，捕获探针B通过其3’末端的靶特异性序列与捕获探针A上复制的目标靶序列单链互补区域杂交，然后洗涤磁珠去除非特异性吸附，将磁珠重新悬浮在缓冲液中；E)在缓冲液中加入DNA聚合酶、dNTP和含Mg2+的缓冲液，杂交的捕获探针B的3’末端以捕获探针A延伸产物为模板进行DNA合成，捕获探针B延伸产物的结构为：公共引物序列P2‑B组特异性引物序列‑目标靶序列‑A组特异性引物序列‑公共引物序列P1；F)洗涤磁珠，通过加热变性使捕获探针B延伸产物从磁珠上解离洗脱下来；收集捕获探针B延伸产物；G)以捕获探针B延伸产物为模板，用公共引物a和b进行文库PCR扩增；扩增产物即为靶序列捕获测序文库。...

【技术特征摘要】
1.一种核酸靶序列捕获测序文库的制备方法，其特征在于：其步骤如下：
a)根据目标靶序列设计并合成两组捕获探针A和B溶液；捕获探针A溶液中捕
获探针A(1,2,3…n)的结构从5’到3’端分别是：生物素标记、公共序列P1
和与靶序列一侧互补的特异性捕获引物序列a(1,2,3…n)；捕获探针B溶液中
捕获探针B(1,2,3…n)的结构从5’到3’端分别是：公共序列P2和与靶序列
一侧相同的特异性引物序列b(1,2,3…n)；
b)在待测的DNA或RNA样品中首先加入捕获探针A溶液，然后同时加入DNA延
伸所需的DNA聚合酶或逆转录酶、dNTP和含Mg2+的缓冲液，捕获探针A通过其
3’端的靶特异性序列a(1,2,3…n)和待测样品中的互补DNA或RNA链杂交，并
且探针的3’末端在DNA聚合酶或逆转录酶的作用下以靶序列为模板进行DNA
合成，将靶序列复制到捕获探针A上，形成有靶序列的捕获探针A单链，捕获
探针A单链的结构为：从5’到3’端分别是生物素标记，公共引物序列P1，
特异性引物序列，目标靶序列；
c)再加入链霉亲合素包被的磁珠，捕获探针A通过其5’末端的生物素标记结
合到链霉亲合素包被的磁珠上，然后分离磁珠，将反应液去除，洗涤磁珠，去
除非特异性吸附；将结合有捕获探针A延伸产物的磁珠重新悬浮在缓冲液中；
d)在含有磁珠的缓冲液中再添加捕获探针B溶液，捕获探针B通过其3’末端
的靶特异性序列与捕获探针A上复制的目标靶序列单链互补区域杂交，然后洗
涤磁珠去除非特异性吸附，将磁珠重新悬浮在缓冲液中；
E)在缓冲液中加入DNA聚合酶、dNTP和含Mg2+的缓冲液，杂交的捕获...

【专利技术属性】
技术研发人员：施小龙，唐超，张海伟，李丽仙，辇伟奇，
申请(专利权)人：重庆市肿瘤研究所，
类型：发明
国别省市：重庆;85