基于微流控芯片的三维细胞微球培养与可控释放方法技术

本发明专利技术提供了一种基于微流控芯片的三维细胞微球培养与可控释放方法，该微流控芯片主要包括凹陷微结构层、流体液路层和气路控制层，所述气路控制层包括气阀控制口，气阀控制通道，所述流体液路层包括进样口，分液通道，细胞接种室和废液通道；所述凹陷微结构层为含有凹陷结构的凹陷阵列结构，按照以下步骤进行：(1)细胞三维微球的形成,(2)细胞三维微球的释放；(3)多尺寸软骨细胞微球的生物功能考察。本发明专利技术将体外细胞三维培养与操控功能集成到一块几平方厘米的芯片上，可以用于体外组织模拟及后续应用。本发明专利技术在微流控技术中可以加入微通道和集成微阀等功能单元，同时对于细胞进行精确控制并实现营养物质交换。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及将微流控芯片技术应用到体内组织工程的模拟与应用领域，具体涉及一种基于微流控芯片的三维细胞微球培养与可控释放方法。
技术介绍
在体外三维培养的方式中，多细胞微球的方式由于能模拟体内的细胞之间的相互作用和功能近年来得到很高的关注。上世纪90年代发展起来的微流控技术，又被称为芯片实验室。借助该技术，可以以可控的方式构建复杂，动态的细胞微环境，因此被广泛运用于细胞生物学和细胞生物医学研究中。该平台技术也为细胞三维培养和细胞检测提供了新的思路。微流控芯片可以制作微米尺度的结构，可用于细胞微球的形成，同时由于该技术的条件灵活性，可以构建更加贴近生物环境的仿生结构。尽管目前的研究已经报道了在微流控芯片上利用微结构形成细胞微球研究细胞的行为，但是由于三维细胞球的复杂结构，常规的检测方式如荧光显微镜不能精确的分析，有时需要脱离芯片进行三维结构特征的生物学分析，所以在微流控芯片上进行细胞微球的精确控制和释放是迫切需要的。在微流控技术中可以加入微通道和集成微阀等功能单元，同时对于细胞进行精确控制并实现营养物质交换。
技术实现思路
本专利技术提供了基于微流控芯片的三维细胞微球培养与可控释放方法，利用多层微流控芯片，可实现高通量的多尺寸的细胞微球形成，细胞微球的培养和微球的可控释放。该方法既可用于高通量的细胞微球的产生和操控，又有利于细胞的在线和离线检测，为干细胞分化和药物筛选等应用提供了一种新平台。一种微流控芯片，该微流控芯片主要由凹陷微结构层、流体液路层和气路控制层3层结构不可逆封接而成，所述气路控制层包括气阀控制口，气阀控制通道，所述气阀控制通道2为Z形状，气阀控制口位于气阀控制通道的右侧端，与废液通道同侧；所述流体液路层包括进样口，分液通道，细胞接种室和废液通道；进样口连接分液通道，分液通道连接细胞接种室，再连接废液通道；所述凹陷微结构层为含有凹陷结构的凹陷阵列结构；所述气路层封接在流体液路层无通道结构的上表面后整理剥离，再与凹陷微结构层的有结构面相对封接；每条气路控制通道与凹陷阵列的行对齐，每行的凹陷结构与每条分液通道对齐，形成微流控芯片的整体结构。所述气阀控制通道高度为200微米，所述的分液通道和废液通道的高度为100微米。凹陷结构阵列为8行，凹陷结构的直径范围为300-650微米，每行的凹陷结构数量为20个，间隔为1毫米；每列之间的间隔为5毫米，凹陷结构阵列通量为160个。所述微流控芯片凹陷微结构层深度为400微米，流体液路层高100微米，气路控制层为200微米。气路控制层中的气路控制通道为Z形，通道宽度为25毫米，数量为8个。一种基于微流控芯片的三维细胞微球培养与可控释放方法，采用上述微流控芯片，按照以下步骤进行：(1)细胞三维微球的形成将软骨细胞消化后，以6×106cells/mL密度接种入芯片进样口，细胞悬液经过分液通道到达细胞接种室中，恒温培养箱37度中培养24h后，细胞在重力的作用下聚集成球，芯片每天更换培养基；(2)细胞三维微球的释放细胞在培养24h后形成细胞微球后，微流控芯片气阀控制通道被连接上了气阀控制器，芯片入口处利用四氟管连接PBS溶液，利用注射泵推动PBS溶液，流速为1μL/h；在气阀控制器的控制下精确控制气阀通道的开启，调节微通道的高度，实现细胞微球的释放；(3)多尺寸软骨细胞微球的生物功能考察软骨微球在微流控上芯片培养7天后，统计软骨细胞微球的直径，同时对软骨细胞微球进行了荧光染色分析，考察了软骨细胞微球II型胶原和蛋白多糖的表达。在气阀控制器的控制下精确控制气阀通道的开启，调节微通道的高度，实现细胞微球的可控释放。微流控芯片的网络通道可以实现细胞的营养物质的交换。所述的细胞表面蛋白表达检测的方法为常规细胞免疫荧光染色。本专利技术提供的微流控芯片，在气阀控制器的控制下精确控制气阀通道的开启，调节微通道的高度，实现细胞微球的释放。微流控芯片的网络通道可以实现细胞的营养物质的交换。利用多层微流控芯片，可实现高通量的多尺寸的细胞微球形成，细胞微球的培养和微球的可控释放。本方法可形成了多尺寸的软骨细胞微球，考察了尺寸对于软骨功能的影响。结果显示该体系可以模拟体内细胞三维环境和细胞密度，研究不同尺寸的软骨微球对于软骨表型维持的影响，三维微球结构有利于软骨细胞表型维持，特异性地表达collagenII和aggrecan蛋白。同时，collagenII和aggrecan蛋白表达也与软骨细胞的数量和细胞紧密程度有关，当细胞微球在150-220μm的直径时，collagenII和aggrecan蛋白表达较强，而在细胞紧密程度高时collagenII和aggrecan蛋白表达也较强。该方法既可用于高通量的细胞微球的产生和操控，又有利于细胞的在线和离线检测，为干细胞分化和药物筛选等应用提供了一种新平台。附图说明图1本专利技术微流控芯片整体结构示意；其中a图为微流控芯片的气路层，b为液路层，c为凹陷微结构层，d图为多层微流控芯片整体结构图，其中1为气阀控制口，2为气阀控制通道，3为进样口，4为分液通道，5细胞接种室，6为废液通道，7为凹陷结构阵列，8为凹陷结构。图2本专利技术微流控芯片细胞可控释放原理示意图。图3微流控芯片可控释放细胞微球实物图。图4软骨细胞在微流控芯片培养7天后的增殖统计图。图5不同尺寸的软骨细胞微球型Ⅱ胶原蛋白差异图6不同尺寸的软骨细胞微球型蛋白多糖蛋白差异具体实施方式下面的实施例将对本专利技术予以进一步的说明，但并不因此而限制本专利技术。一种微流控芯片，如图1所示，该微流控芯片主要由凹陷微结构层、流体液路层和气路控制层3层结构不可逆封接而成，所述气路控制层包括气阀控制口1，气阀控制通道2，所述气阀控制通道2为Z形状，气阀控制口1位于气阀控制通道2的右侧端，与废液通道(6)同侧；所述流体液路层包括进样口3，分液通道4，细胞接种室5和废液通道6；进样口3连接分液通道4，分液通道4连接细胞接种室5，再连接废液通道6；所述凹陷微结构层为含有凹陷结构8的凹陷阵列结构7；所述气路层封接在流体液路层无通道结构的上表面后整理剥离，再与凹陷微结构层的有结构面相对封接；每条气路控制通道与凹陷阵列的行对齐，每行的凹陷结构与每条分液通道对齐，形成微流控芯片的整体结构。所述气阀控制通道高度为200微米，所述的分液通道和废液通道的高度为100微米。凹陷结构阵列为8行，凹陷结构的直径范围为300-650微米，每行的凹陷结构数量为20个，间隔为1毫米；每列之间的间隔为5毫米，凹陷结构阵列通量为160个。所述微流控芯片凹陷微结构层深度为400微米，流体液路层高100微米，气路控制层为200微米。气路控制层中的气路控制通道为Z形，通道宽度为25毫米，数量为8个。一种基于微流控芯片的三维细胞微球培养与可控释放方法，采用上述微流控芯片，按照以下步骤进行：(1)细胞三本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种微流控芯片，其特征在于：该微流控芯片主要由凹陷微结构层、流体液路层和气路控制层3层结构不可逆封接而成，所述流体液路层包括进样口(3)，分液通道(4)，细胞接种室(5)和废液通道(6)；进样口(3)连接分液通道(4)，分液通道(4)连接细胞接种室(5)，再连接废液通道(6)；所述气路控制层包括气阀控制口(1)和气阀控制通道(2)，所述气阀控制通道(2)为Z形状，气阀控制口(1)位于气阀控制通道(2)的右侧端，与废液通道(6)同侧；所述凹陷微结构层为含有凹陷结构(8)的凹陷阵列结构(7)；所述气路层封接在流体液路层无通道结构的上表面后整理剥离，再与凹陷微结构层的有结构面相对封接；每条气路控制通道与凹陷阵列的行对齐，每行的凹陷结构与每条分液通道对齐，形成微流控芯片的整体结构。

【技术特征摘要】
1.一种微流控芯片，其特征在于：该微流控芯片主要由凹陷微结构层、流
体液路层和气路控制层3层结构不可逆封接而成，
所述流体液路层包括进样口(3)，分液通道(4)，细胞接种室(5)和废液通道(6)；
进样口(3)连接分液通道(4)，分液通道(4)连接细胞接种室(5)，再连接废液通道(6)；
所述气路控制层包括气阀控制口(1)和气阀控制通道(2)，所述气阀控制通
道(2)为Z形状，气阀控制口(1)位于气阀控制通道(2)的右侧端，与废液通道
(6)同侧；
所述凹陷微结构层为含有凹陷结构(8)的凹陷阵列结构(7)；
所述气路层封接在流体液路层无通道结构的上表面后整理剥离，再与凹陷
微结构层的有结构面相对封接；每条气路控制通道与凹陷阵列的行对齐，每行
的凹陷结构与每条分液通道对齐，形成微流控芯片的整体结构。
2.按照权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：所述气阀控制通道高
度为200微米，所述的分液通道和废液通道的高度为100微米。
3.按照权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：凹陷结构阵列为8行，
凹陷结构的直径范围为300-650微米，每行的凹陷结构数量为20个，间隔为1
毫米；每列之间的间隔为5毫米，凹陷结构阵列通量为160个。
4.按照权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：所述微流控芯片凹陷
微结构层深度为400微米，流体液路层高100微米，气路控制层为200微米。
5.按照权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：气路控制层中的气路
控制通道为Z形，通道宽度为25毫米，...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦建华，石杨，张旭，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁;21