DC-CTL细胞的培养方法技术

本发明专利技术属于细胞生物学领域，公开了一种DC‑CTL细胞的培养方法。本发明专利技术所述DC‑CTL细胞的培养方法将单个核细胞接种X‑VIVO15无血清培养基培养后分别收集贴壁细胞和未贴壁细胞；贴壁细胞接种含细胞因子的X‑VIVO15无血清培养基培养，肿瘤抗原致敏，得到致敏的DC细胞；未贴壁细胞接种含胶原‑海藻酸钠‑羟基磷灰石支架材料及细胞因子的X‑VIVO15无血清培养基诱导培养CIK细胞；将致敏的DC细胞和CIK细胞混合培养得到DC‑CTL细胞。本发明专利技术所述培养方法在细胞培养中形成三维培养模型，使CTL细胞在三维空间内增殖，培养得到的DC‑CTL细胞状态好、增殖速度快、增殖倍数高，杀伤效果好。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于细胞生物学领域，具体涉及一种DC-CTL细胞的培养方法，尤其是DC-CTL细胞的三维培养方法。
技术介绍
肿瘤是指机体在各种致瘤因子作用下，局部组织细胞增生所形成的新生物，因为这种新生物多呈占位性块状突起，也称赘生物。根据新生物的细胞特性及对机体的危害性程度，又将肿瘤分为良性肿瘤和恶性肿瘤两大类，而癌症即为恶性肿瘤的总称。传统的肿瘤治疗方法有手术治疗、放疗和化疗。目前的肿瘤治疗中，手术和放化疗等局部治疗对局限性肿瘤有较好的疗效，而对于全身性、转移性或局部治疗后的微小病灶则主要依靠免疫疗法进行系统性治疗。根据每个肿瘤病人的特点，采取局部治疗结合免疫细胞治疗不仅可以消除局部病灶肿瘤，还可以控制肿瘤的复发、转移生长等，提高病人的生存期和生活质量。细胞免疫治疗是一种新兴的治疗技术。细胞免疫治疗疗法是采集人体自身免疫细胞，经过体外培养，使其数量成百倍增多，靶向性杀伤功能增强，然后再回输到人体来杀灭血液及组织中的病原体、癌细胞、突变的细胞，打破免疫耐受，激活和增强机体的免疫能力，兼顾治疗和保健的双重功效。细胞免疫治疗可以恢复与增强肿瘤患者自身的免疫监测和杀瘤功能，有效地杀灭患者术后和放化疗后体内残存的肿瘤细胞，达到治疗肿瘤、预防复发与转移和最终根治肿瘤的目的，具有特异性强、副作用轻等优点。CTL细胞是肿瘤抗原浸润过的T细胞群，在经DC细胞提呈刺激后可获得具有高效杀伤特定的一种或几种肿瘤细胞的CTL细胞，在临床免疫细胞治疗中具有非常重要的作用。在CTL细胞常规培养中，主要是利用DC细胞培养、肿瘤抗原刺激DC细胞成熟，混合培养DC和CTL细胞，得到特异性杀伤一种或几种肿瘤的免疫细胞。已有的专利技术中DC-CTL细胞的培养方案如下：1.外周血单个核细胞分离采集；2.DC和T细胞的分离培养，单个核细胞接种T175培养瓶30-60min，贴壁的即为DC细胞，未贴壁的即为外周血总T细胞；3.DC细胞培养至第6天加入特定肿瘤相关抗原，培养至第8天，收集DC疫苗，用于CTL培养；4.外周血总T细胞培养CIK，至第8天，CIK细胞半量与DC细胞混合获得CTL细胞，半量继续培养CIK。5.培养至14天收集所有细胞获得DC-CIK-CTL细胞。然而传统培养瓶培养，当细胞增殖培养时，大量的成团细胞很容易沉于底部，与营养液接触面积少，不利于细胞的快速增殖。而且在第8天DC细胞与CIK细胞混合后，因细胞成团沉于底部，与DC细胞不能充分接触混匀，DC细胞的抗原提呈效果不够。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于针对现有技术存在的问题，提供一种DC-CTL细胞的培养方法。本专利技术所述培养方法利用胶原-海藻酸钠-羟基磷灰石支架材料的多孔性、组织相容性和稳定性，在细胞培养中形成三维培养模型，以解决CTL细胞在增殖过程中成团细胞堆积底部而无法很好的接触培养液以及与DC细胞不能充分接触混匀的问题。为了实现本专利技术的目的，本专利技术采用如下技术方案：一种DC-CTL细胞的培养方法，包括步骤1、单个核细胞接种X-VIVO15无血清培养基培养后分别收集贴壁细胞和未贴壁细胞；步骤2、贴壁细胞接种含细胞因子的X-VIVO15无血清培养基培养，肿瘤抗原致敏，得到致敏的DC细胞；步骤3、未贴壁细胞接种含胶原-海藻酸钠-羟基磷灰石支架材料及细胞因子的X-VIVO15无血清培养基诱导培养CIK细胞；步骤4、将致敏的DC细胞和CIK细胞混合培养得到DC-CTL细胞。海藻酸钠是一种酸性的多聚糖，具有良好的生物相容性，目前已经被广泛应用于化学、生物、医药、食品等领域。本专利技术所述培养方法通过机械混合、冷冻干燥制备得到的胶原-海藻酸钠-羟基磷灰石支架材料具有多孔性、组织相容性和稳定性。在体外细胞培养中，将圆柱体胶原-海藻酸钠-羟基磷灰石支架材料浸没于培养基中，将生长状态良好的细胞接种于培养液中，细胞在三维空间内增殖，空间更大、接触到的培养液面积更充足，避免细胞在增殖过程中成团细胞堆积底部，不能很好的继续增殖。其中，在一些实施方案中，所述DC-CTL细胞的培养方法中所述胶原-海藻酸钠-羟基磷灰石支架材料完全浸没于X-VIVO15无血清培养基中。在一些实施方案中，所述胶原-海藻酸钠-羟基磷灰石支架材料的制备方法为动物胶原溶解于酸性溶液溶解得到浓度为5mg/mL的酸性胶原溶液，依次加入0.3mol/L的Na2HPO4·12H2O溶液和2％海藻酸钠溶液混合，调节pH至9.0，加入羟基磷灰石混匀后倒入模具成型，升温至25℃凝胶后，低温预冻后冻干；其中所述羟基磷灰石：胶原：海藻酸钠的质量百分比为(40％-50％):(30％-40％):(20％-30％)。在一些具体实施例中，所述羟基磷灰石：胶原：海藻酸钠的质量百分比为40％:40％:20％。在一些具体实施例中，所述羟基磷灰石：胶原：海藻酸钠的质量百分比为30％:50％:20％。在一些具体实施例中，所述羟基磷灰石：胶原：海藻酸钠的质量百分比为30％:40％:30％。在一些实施方案中，所述DC-CTL细胞的培养方法中所述单个核细胞接种X-VIVO15无血清培养基的接种量为2×106个/mL-8×106个/mL。在一些实施方案中，本专利技术所述培养方法所述步骤2具体为贴壁细胞接种含IL-4和GM-SCF的X-VIVO15无血清培养基，3天后补加GM-SCF和IL-4，培养至4-6天后添加新鲜的X-VIVO15无血清培养基，同时添加GM-SCF、IL-4、TNF-α和肿瘤抗原得到致敏的DC细胞。在一些优选实施方案中，步骤2中接种时所述IL-4和GM-SCF的终浓度均为100-1000U/mL。即接种时所述IL-4的终浓度优选为100-1000U/mL、GM-SCF的终浓度优选为100-1000U/mL。在一些优选实施方案中，步骤2中3天后补加时所述IL-4和GM-SCF的终浓度均为100-1000U/mL。即3天后补加时所述IL-4的终浓度优选为100-1000U/mL、GM-SCF的终浓度优选为100-1000U/mL；在一些优选实施方案中，步骤2中培养4-6天后添加的IL-4和GM-SCF的终浓度均为50-500U/mL。即培养4-6天后添加的IL-4的终浓度优选为50-500U/mL、GM-SCF的终浓度优选为50-500U/mL。在一些优选实施方案中，步骤2中所述TNF-α的终浓度为100-1000U/mL。本领域技术人员本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种DC‑CTL细胞的培养方法，其特征在于，包括步骤1、单个核细胞接种X‑VIVO15无血清培养基培养后分别收集贴壁细胞和未贴壁细胞；步骤2、贴壁细胞接种含细胞因子的X‑VIVO15无血清培养基培养，肿瘤抗原致敏，得到致敏的DC细胞；步骤3、未贴壁细胞接种含胶原‑海藻酸钠‑羟基磷灰石支架材料及细胞因子的X‑VIVO15无血清培养基诱导培养CIK细胞；步骤4、将致敏的DC细胞和CIK细胞混合培养得到DC‑CTL细胞。

【技术特征摘要】
1.一种DC-CTL细胞的培养方法，其特征在于，包括
步骤1、单个核细胞接种X-VIVO15无血清培养基培养后分别收集贴壁细
胞和未贴壁细胞；
步骤2、贴壁细胞接种含细胞因子的X-VIVO15无血清培养基培养，肿瘤
抗原致敏，得到致敏的DC细胞；
步骤3、未贴壁细胞接种含胶原-海藻酸钠-羟基磷灰石支架材料及细胞因
子的X-VIVO15无血清培养基诱导培养CIK细胞；
步骤4、将致敏的DC细胞和CIK细胞混合培养得到DC-CTL细胞。
2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述胶原-海藻酸钠-
羟基磷灰石支架材料完全浸没于X-VIVO15无血清培养基中。
3.根据权利要求1或2所述的培养方法，其特征在于，所述胶原-海藻酸钠
-羟基磷灰石支架材料的制备方法为动物胶原溶解于酸性溶液溶解得到浓度为
5mg/mL的酸性胶原溶液，依次加入0.3mol/L的Na2HPO4·12H2O溶液和2％海藻
酸钠溶液混合，调节pH至9.0，加入羟基磷灰石混匀后倒入模具成型，升温至
25℃凝胶后，低温预冻后冻干；其中所述羟基磷灰石：胶原：海藻酸钠的质
量百分比为(40％-50％):(30％-40％):(20％-30％)。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的培养方法，其特征在于，所述单个核
细胞接种X-VIVO15无血清培养基的接种量为2×106个/mL-8×106个/mL。
5.根据权利要求1-4任意一项所述的培养方法，其特征在于，步骤2具体
为贴壁细胞接种含IL-4和GM-SCF的X-VIVO15无血清培养基，3天后补加
GM...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈海佳，王一飞，葛啸虎，应杰，李平，
申请(专利权)人：广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44