一种促进植物甾醇转化为9α-羟基雄烯二酮的方法技术

本发明专利技术涉及一种使用Nocardia canicruria ATCC 17896菌种将植物甾醇转化为9α-羟基雄烯二酮的方法，特别是的方法中使用了超声波震荡。

【技术实现步骤摘要】
专利
本专利技术涉及一种使用NocardiacanicruriaATCC17896菌种将植物甾醇转化为9α-羟基雄烯二酮的方法，特别是的方法中使用了超声波震荡。
技术介绍
：雄甾4-烯-3，17-双酮(androst-4-ene-3，17-dione，简称：雄烯二酮或AD)是甾体激素类药物不可替代的中间体，对机体起着非常重要的调节作用。可以说几乎所有甾体激素药物都是以AD作为起始原料进行生产的。如用于生产性激素、孕激素、蛋白同化激素及皮质激素，又可用于合成氢化可的松，氧化泼尼松，黄体酮、雌烯醇、地塞米松等100余种药物，也是直接用于生产抗早孕药米非司酮和各类计划生育用药的必不可少的基本原料。如今AD不断被一些发达国家用于开发和生产新的医药主品，如福美司坦(Formestane或Lentaron)，等及类固醇类激素免疫抗原等，目前全世界范围内，AD的应用领域日益拓宽，用AD做原材料生产的医药品种不断增加。由于化学全合成雄烯二酮成本较高，国内外很多科学家一直研究如何通过生物发酵方法得到雄烯二酮。50年代，美国Upjohn公司首先利用侧链上有双链的大豆甾醇和麦角甾醇为原料生产出雄甾-4-烯-3，17二酮(AD)及雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮(ADD)并以此作为合成甾体药物的原料。近年来，由于甾体药物应用量逐年增加，人们的目光又转到在动植物界中含量较多的胆甾醇，谷甾醇，菜油甾醇等，并被认为是具有巨大潜能的甾体激素类药物的起始原料。20世纪60年代中期，由Sih等首先发现有些微生物可以选择性降解切除甾醇的饱和侧链而得到AD和ADD，70年代初，日本的有马启利用微生物降解胆甾醇生产ADD获得成功，受到许多制药公司的高度重视。为了大量生产类固醇激素，研究者试图使用甾醇为唯一碳源分离微生物和改变甾醇结构用作发酵的底物，并用能防止甾醇核降解的化学添加剂来提高类固醇的收得率，这一努力己获得很大进展(Marsheck等，ApliedMicroobiology，23(1)：72～77，1972)。此外，埃及国家研究中心生物与天然产品化学系的和Sallam等研究发现，利用磷酸盐缓冲液调节底物培养基pH值5.5～7.38可提高生物降解AD、ADD的转化率。Upjohn公司在美国专利No.4，293，644中描述了一种通过分枝杆菌(ATCC29472)的突变株从多种类固醇中得到以高产量的雄-4-烯-3，17-二酮(AD)为主，并有少量雄-1，4-二烯-3，l7-二酮(ADD)的产物的方法。以后的研究发现节杆菌，诺卡氏菌和分枝杆菌等微生物均可用于直接切除甾醇的饱和侧链，在一定条件下得到AD和ADD，这使得微生物转化工业化生产成为可能。在生物发酵法制备AD和ADD的基础上，近年来研发发现如果采用发酵法以9α-OH-AD为原料可以更为便捷的制备皮质激素。根据皮质激素的构效关系，甾体激素的11位具有β羟基才能具有更为强大的药效，按照目前引入11β羟基的普遍技术，需要在9或11位引入α羟基，才便于通过化学方法引入11β羟基。所以雄烯二酮为原料制备皮质激素药物则需要再一次发酵得到9或11位为α羟基的产物。9α-羟基雄烯二酮(雄甾-9α-羟基-4-烯-3，17-二酮)在甾环的9位具有-OH取代基，与雄烯二酮相比便于通过化学方法引入11β羟基，11位具有β羟基才能具有更为强大的药效。这样从植物甾醇就要进行两步发酵，如果能以植物甾醇为原料通过发酵一步得到9α-羟基雄烯二酮，则能够节约大量的人力、物力，更够更有效的提高工作效率。目前，主要存在两条途径获得9α-OH-AD。其一，两步发酵法，即首先经由分枝杆菌对甾醇(谷甾醇、胆甾醇)发酵断侧链，生产AD；再使用其它的微生物(例如诺卡氏或红球菌属)对AD再进行9α-羟基化，例如魏长龙等人(NocardiacanicruriaBF313催化甾体9α-羟基化发酵工艺优化，食品工业科技，2014年18期，320页)报道以雄烯二酮为原料，以NocardiacanicruriaBF313作为实验菌株，研究了以雄烯二酮为原料生物法制备9α-羟基-雄烯二酮的发酵工艺，考察了转化培养基成分、投料方式、初始PH值等因素，灭菌前调PH为7.0，以4％的接种量接种，预培养16小时后以拟结晶方式投加底物，经过48小时的转化，在投料浓度为10g/L情况下，底物转化率可高达97.2％，在投料浓度20g/L情况下，底物转化率也可达87.2％。其二，利用微生物一步法直接发酵甾醇，生产目标产物9α-OH-AD。例如分枝杆菌属亲株的球形原生质体经诱变处理后，选择出一株突变株M.roseum，该突变株在系统分类学上区别于已知的甾醇降解分枝杆菌，能高活力地由甾醇产生9-OH-AD。通常菌株在缺失3-酮甾体-1(2)-脱氢酶的背景下，才可能作为主要代谢产物积累9-OH-AD。分枝杆菌B-8119和其后的M.vccae均证实了分枝杆菌在甾醇转化中存在两种截然不同的酶与3,17-二酮甾体1(2)-脱氢作用有关，它们二者的差别在于对AD和9-OH-AD的专一性。俄罗斯Donova等报道由谷甾醇产生9-OH-AD分枝杆菌突变菌株的研究。在这一工作中，作者应用豆甾醇的选择压力，结合传统诱变作用的合理组合，以获得能够转化豆甾醇成为9-OH-AD的菌株。使用的亲本菌株分枝杆菌sp.Ac-1815D诱变选育过程如下：在琼脂培养基上6/2菌株生长培养期间生长成不同类型的菌落。在谷甾醇培养基上6/2菌株继代生长培养10次后，分离到S-型菌落。获取的最好菌落产生9-OH-AD(标示为6/2S)。此外生物发酵方法研究较多的是菌种，但发酵效果除了与菌种本身密切相关外，菌种在发酵过程中所使用的方法也十分重要。杨英在文章中指出(微生物降解甾醇侧链转化雄甾-4-烯-3，17-二酮的研究进展，微生物学通报，2006年33(6)，142-145)甾醇底物在水溶液培养基中溶解度差和存在严重的产物(底物)抑制的问题一直困扰了整个甾类工业，甾醇是一种疏水性化合物,在水中溶解度极低,这就导致底物与微生物细胞不能很好的接触,使转化率偏低及转化时间延长。采用超声破碎、表面活性剂及有机溶剂来溶解底物虽然取得了一定成果,但表面活性剂和有机溶剂对细胞的活性有一定的抑制从而制约了它的应用。同时以植物甾醇为原料利用Nocardia(诺卡氏)菌株发酵得到9α-羟基雄烯二酮，时间较长，往往长达72小时，而长时间发酵的问题在于首先是容易造成微生物过分发酵，将得到的产物转化为9α-羟基睾酮本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种由植物甾醇组合物为底物通过Nocardia canicruria ATCC 17896制备9α‑羟基‑雄甾‑4烯‑3，17二酮的方法，其特征在于在20‑37℃之间进行发酵，并使用超声波震荡。

【技术特征摘要】
1.一种由植物甾醇组合物为底物通过NocardiacanicruriaATCC17896制备9
α-羟基-雄甾-4烯-3，17二酮的方法，其特征在于在20-37℃之间进行发酵，
并使用超声波震荡。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于植物甾醇组合物在发酵液中的浓
度为10-100g/L。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于超声波震荡频率为25-100KHz。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于发酵培养阶段结束前进行超声波
震荡。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于发酵温度为...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙亮，
申请(专利权)人：天津金耀集团有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12