一种寨卡病毒荧光PCR检测试剂盒制造技术

一种寨卡病毒荧光PCR检测试剂盒。本发明专利技术涉及一种用于检测寨卡病毒试剂盒，特别是涉及一种利用实时荧光聚合酶链式反应技术同时检测寨卡病毒RNA。本试剂盒主要包括RT‑PCR反应液、引物探针混合液、RT‑PCR反应酶系、DEPC H2O以及分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。由于本试剂盒通过Taqman探针检测的方式，应用一步法实时荧光PCR反应模式，能准确快速检测寨卡病毒RNA，可广泛应用于寨卡病毒病临床早期诊断、疫情防控及科学研究等多个领域。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种寨卡病毒荧光PCR检测试剂盒，特别是涉及一种利用实时荧光聚合酶链式反应技术一步法检测寨卡病毒NS1基因的试剂盒。
技术介绍
寨卡病毒病(ZikaVirusDisease)是由寨卡病毒(ZikaVirus)引起并通过蚊媒传播的一种自限性急性疾病，主要通过埃及伊蚊叮咬传播。临床特征主要为发热、皮疹、关节痛或结膜炎，极少引起死亡。世界卫生组织(WHO)认为，新生儿小头畸形、格林-巴利综合征(吉兰-巴雷综合征)可能与寨卡病毒感染有关。带病毒的伊蚊叮咬是本病最主要的传播途径。传播媒介主要为埃及伊蚊，白纹伊蚊、非洲伊蚊和黄头伊蚊也可能传播该病毒。亦可通过母婴传播，包括宫内感染和分娩时感染。乳汁中可检测到寨卡病毒核酸，但尚无通过哺乳感染新生儿的报道。罕见血源传播和性传播。寨卡病毒于1947年首次在乌干达从恒河猴体内被发现，1952年在乌干达和坦桑尼亚的人体中分离到。2007年以前，全球仅报告14例寨卡病毒病散发病例，2007年首次在太平洋岛国密克罗尼西亚的雅普岛发现寨卡病毒暴发疫情，其后发现寨卡病毒感染病例和暴发疫情的国家及地区有增加趋势。2015年5月，巴西报告首例寨卡病毒病病例，截至2016年1月，至少在非洲、亚洲、美洲的45个国家有寨卡病毒传播的证据，以巴西疫情最为严重。我国广东省、台湾也报告2例来自泰国的输入性病例。在寨卡病毒疫情发生时，巴西等国新生儿小头畸形病例数显著增加，现有证据提示，新生儿小头畸形可能与孕妇寨卡病毒感染有关。疫情的快速蔓延以及与小头畸形之间的可能因果关系，引起了国际社会的广泛关注。寨卡病毒病主要在全球热带及亚热带地区流行。我国南方部分地区存在可传播寨卡病毒的媒介伊蚊，近年来与之传播方式相似的登革热输入性疫情持续增多，并在南方部分省份引起了较大规模的暴发疫情。随着与相关国家或地区人员往来的日益密切，我国存在寨卡病毒输入风险。根据监测，我国有与传播寨卡病毒有关的伊蚊种类主要为埃及伊蚊和白纹伊蚊，其中埃及伊蚊主要分布于海南省、广东省雷州半岛以及云南省的西双版纳州、德宏州、临沧市等地区；白纹伊蚊则广泛分布于我国河北、山西、陕西以南广大区域。特别是我国南方地区夏秋季节伊蚊密度较高，一旦有病例输入，不排除在局部地区发生本地传播扩散的可能。因此，建立一种快速检测寨卡病毒病原体的方法具有重要的应用价值。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种利用实时荧光聚合酶链式反应技术对寨卡病毒NS1基因进行检测的试剂盒，利用本试剂盒可以准确检测寨卡病毒。根据GenBank中登录的寨卡病毒的NS1基因序列，应用DNAMAN软件进行同源性分析，并找出各个病毒的保守区。应用Oligo7.0软件根据病毒基因的保守区基因设计特异性的引物及探针，并通过NCBI的BLAST功能对其特异性进行初步鉴定。引物和探针在含有耐热DNA聚合酶，逆转录酶、高质量脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)的RT-PCR反应酶系以及含有Mg2+等成份的RT-PCR反应液中，通过荧光PCR仪实现体外核酸的循环扩增。本专利技术所涉及的试剂盒主要包括：1)RT-PCR反应液、引物探针混合液、RT-PCR反应酶系、DEPCH2O，阴性质控品、阳性质控品和2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。本专利技术的一个优选实施方案是引物、探针混合液由特异性的正、反向引物，特异性的探针组成，其特征在于特异性的正向和反向引物的序列分别是5’-TACAAGTACCATCCTGACTCCC-3’，5’-CYGTCAGTTGYACTCCATTCTC-3’；特异性的探针的序列是5’-AGCTCCCCTTCYACTGATYTCCACAT-3’，探针的5’和3’端分别结合有荧光发生基团FAM和荧光淬灭基团BHQ1。本专利技术的另一个优选实施方案是引物探针混合液中引物浓度为0.2～0.5μmol/L，探针浓度为0.1～0.25μmol/L。本专利技术的另一个优选实施方案是RT-PCR反应液由Tris-HCl(50mmol/L，pH8.0～8.8)、MgCl2(3～8mmol/L)、KCl(150～350mmol/L)组成。本专利技术的另一个优选实施方案是RT-PCR反应酶系由热启动Taq酶、逆转录酶、dNTPs组成。逆转录酶可选择MMLV等常用逆转录酶。热启动Taq酶、逆转录酶、dNTPs均可采用市售产品，如Qiagen公司的产品，其中每人份RT-PCR反应酶系中热启动Taq酶的用量为5～10U，逆转录酶用量为1.5～5U，dNTPs用量为6～12mmol。本专利技术的另一个优选实施方案是PCR扩增的条件为：50℃15分钟，94℃5分钟；95℃15秒，55℃35秒，40个循环(退火时收集荧光信号)。本专利技术的一个优选实施方案是试剂盒提供了质控品，分别为阴性质控品和阳性质控品。阴性质控品为生理盐水，阳性质控品为人工合成的含有NS1基因目的基因的体外转录RNA。试剂盒中进行待检标本检测可同时进行两种质控品的检测，仅当阳性质控品检测时FAM通道荧光信号呈阳性，阴性质控品检测FAM通道荧光信号呈阴性时，待检标本的检测结果才有效。本专利技术的试剂盒扩增待检标本由市售的荧光定量PCR仪自动完成，操作简单，耗时少，且最大限度地减少了污染的发生。准确检测寨卡病毒NS1基因，可广泛应用于寨卡病毒疾病临床早期诊断、口岸检验检疫、疫情防控及科学研究等多个领域。本专利技术与现有技术相比优点为：(1)对寨卡病毒核酸扩增水平进行检测，可反映出样本中寨卡病毒感染的状态，可用于寨卡病毒的监测和防控及临床诊断，有助于寨卡病毒的早期诊断和治疗；(2)针对寨卡病毒NS1基因特异性序列设计专用引物、探针，保证检测的特异性和准确性，也具有较高通量，操作简便、相对降低成本的优点；(3)检测过程只需1.5h，大大减少了工作量，提高了检测效率；相对于已有的核酸杂交法检测技术，检测所需时间缩短了一半以上；(4)试剂采用阴、阳性质控品作为质控，能够对试剂的质量进行严格的把控；(5)试剂采用RT-PCR反应液、引物探针混合液、RT-PCR反应酶系的大包装设置，适合多种荧光检测设备，具有适用性更加广泛的特点。附图说明图1显示PCR扩增的反应条件。图2显示标准品的扩增曲线。图中FAM通道的扩增曲线为S型，说明试剂盒具有很好的线性相关性，且可以检出100copies/mL的浓度样本。图3显示试剂盒阴性质控品的扩增曲线。图中没有S型扩增曲线，说明FAM通道荧光信号均呈阴性。图4显示试剂盒阳性质控品的扩增曲线。图中FAM通道的扩增曲线为S型，说明该通道的荧本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种寨卡病毒荧光PCR检测试剂盒，包括：1)RT‑PCR反应液、引物探针混合液、RT‑PCR反应酶系、DEPC H2O，阴性质控品、阳性质控品和2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒，其中引物探针混合液由寨卡病毒特异性的正、反向引物及特异性的探针组成，其特征在于：特异性的正向和反向引物分别是5’‑TACAAGTACCATCCTGACTCCC‑3’和5’‑CYGTCAGTTGYACTCCATTCTC‑3’；特异性的探针的序列是5’‑AGCTCCCCTTCYACTGATYTCCACAT‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种寨卡病毒荧光PCR检测试剂盒，包括：1)RT-PCR反应液、引物探针混合液、RT-PCR
反应酶系、DEPCH2O，阴性质控品、阳性质控品和2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的
包装盒，其中引物探针混合液由寨卡病毒特异性的正、反向引物及特异性的探针组成，其
特征在于：特异性的正向和反向引物分别是5’-TACAAGTACCATCCTGACTCCC-3’和5’
-CYGTCAGTTGYACTCCATTCTC-3’；特异性的探针的序列是5’
-AGCTCCCCTTCYACTGATYTCCACAT-3’。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征还在于所述探针的5’端和3’端分别结合有荧光
发生基团FAM和荧光淬灭基团BHQ1。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征还在于引物探针混合液中引物浓度为0.2～
0.5μmol/L，探针浓度为0.1～0...

【专利技术属性】
技术研发人员：李明，何皖平，周其伟，蒋析文，高秀洁，夏乔，尤欢，叶爱华，吴洁，
申请(专利权)人：中山大学达安基因股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44