含有血红素的多肽的分泌制造技术

本发明专利技术提供用于表达和分泌含有血红素的多肽的方法和组合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请案的交叉引用本申请案要求2013年9月11日提交的美国临时申请案第61,876,676号、2013年11月25日提交的美国临时申请案第61/908,689号的优先权；并且与以下专利申请案相关：2012年7月12日提交的申请案第PCT/US12/46560号；2013年7月12日提交的申请案第PCT/US12/46552号；2013年1月11日提交的美国临时申请案第61/751,816号；以及2013年1月11日提交的美国申请案第61/751,818号，所述申请案全部以全文引用的方式并入本文中。
本专利技术涉及制造含有血红素的多肽的方法和材料，并且更具体来说，涉及在例如芽孢杆菌细胞的重组细菌细胞中或在重组植物或植物细胞中制造含有血红素的多肽。
技术介绍
持续需要大规模制造蛋白质用于工业和食品目的的方法。芽孢杆菌菌种可用于制造例如脂肪酶和蛋白酶的工业酶。另外，这些宿主中可产生例如葡糖淀粉酶、脂肪酶和淀粉酶的许多食品添加剂，提供在食品行业中安全使用的长历史。芽孢杆菌菌种可向细菌周围的培养基中分泌高含量蛋白质。例如普通烟草(Nicotianatabacum)或大豆(Glycinemax)的植物物种也可以用于产生蛋白质。含有血红素的多肽可能难以作为辅因子分泌，必须插入到多肽中并且在整个分泌过程中保持以其原生构形与多肽关联。芽孢杆菌菌种可使用两种不同系统来分泌蛋白质(SEC和TAT)。SEC路径在蛋白质穿过细胞膜时使其去折叠。TAT系统可分泌折叠状态的蛋白质。然而，不清楚含有非共价结合的血红素基团的重组血红素蛋白是否可以通过芽孢杆菌系统适当表达、分泌和折叠，直到其成功地进行。
技术实现思路
一方面，本文提供能够分泌含有血红素的多肽的重组细菌细胞(例如芽孢杆菌细胞，例如枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)或地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)细胞)。所述细胞包括至少一种外源性核酸，所述外源性核酸包含第一和第二核酸序列，其中第一核酸序列编码信号肽并且第二核酸序列编码含有血红素的多肽，其中第一和第二核酸序列可操作地连接产生包含信号肽和含有血红素的多肽的融合多肽。外源性核酸还可包括编码标签(例如亲和力标签)的第三核酸序列。细胞可以分泌来自细胞的含有血红素的多肽，并且当分泌时，从含有血红素的多肽去除信号肽。信号肽可包含与以下中阐述的信号肽具有至少60％一致性的氨基酸序列或由其组成：SEQIDNO:33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91或93。举例来说，信号肽可包含与SEQIDNO:55中阐述的氨基酸序列或SEQIDNO:55的残基1-52具有至少60％氨基酸序列一致性的氨基酸序列或由其组成。本文还提供一种用于制造含有血红素的多肽的方法。所述方法包括在培养基中在允许含有血红素的多肽分泌到培养基中的条件下培养重组细菌细胞(例如芽孢杆菌细胞，例如枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌细胞)，重组细菌细胞包含至少一种外源性核酸，外源性核酸包含第一和第二核酸序列，其中第一核酸序列编码信号肽并且第二核酸序列编码含有血红素的多肽，其中第一和第二核酸序列可操作地连接产生包含信号肽和含有血红素的多肽的融合多肽，且其中当融合多肽从细胞分泌到培养基中时，从含有血红素的多肽去除信号肽。所述方法进一步可包括从培养基回收含有血红素的多肽。信号肽可包含与以下中阐述的信号肽具有至少60％一致性的氨基酸序列或由其组成：SEQIDNO:33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91或93。举例来说，信号肽可包含与SEQIDNO:55中阐述的氨基酸序列或SEQIDNO:55的残基1-52具有至少60％氨基酸序列一致性的氨基酸序列或由其组成。另一方面，本文提供产生含有血红素的多肽的重组植物或植物细胞(大豆、玉米、大麦或阿拉伯芥植物或植物细胞)。植物或植物细胞可包括至少一种编码含有血红素的多肽的外源性核酸，其中植物或植物细胞来自除烟草以外的物种。外源性核酸进一步可包括调节控制元件，例如启动子(例如组织特异性启动子，例如叶、根、茎或种子)。外源性核酸也可以编码将含有血红素的多肽靶向亚细胞位置的信号肽，所述亚细胞位置例如油体、液泡、色素体(例如叶绿体)或其它细胞器。本文还提供一种制造含有血红素的多肽的方法。所述方法可包括生长重组植物(大豆、玉米、大麦或阿拉伯芥植物)，所述重组植物包含至少一种编码含有血红素的多肽的外源性核酸，其中植物来自除烟草以外的物种，并且从植物组织纯化含有血红素的多肽。另一方面，本文提供一种载体，其包括编码含有血红素的多肽的多核苷酸序列；以及编码信号肽的多核苷酸序列，其中信号肽包含与表1中所列的信号肽具有至少60％氨基酸序列一致性的氨基酸序列或由其组成。举例来说，信号肽可包括与SEQIDNO:55中阐述的氨基酸序列或SEQIDNO:55的残基1-52具有至少60％氨基酸序列一致性的氨基酸序列。在一些实施例中，信号肽包含SEQIDNO:55的残基1-52的氨基酸序列或由其组成。编码含有血红素的多肽的多核苷酸序列可与启动子可操作地连接。另一方面，本文提供一种组合物，其包括经纯化的含有血红素的多肽；以及重组芽孢杆菌细胞(例如枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌细胞)或除烟草植物细胞以外的重组植物细胞(例如重组芽孢杆菌细胞或重组植物细胞的非天然存在的组分)。在一些情况下，含有血红素的多肽不天然存在于宿主细胞中。植物细胞可为例如大豆植物细胞、玉米植物细胞或阿拉伯芥植物细胞。组合物可包括至少1ppb所述细胞组分或至多1重量％细胞组分。本文还提供一种载体，其包含编码含有血红素的多肽、信号肽；以及标签的多核苷酸序列，其中多核苷酸序列在宿主细胞中的表达产生含有含有血红素的多肽、信号肽和标签(例如亲和力标签，例如6-组氨酸标签或可检测标签)的融合蛋白，以及含有此类载体的遗传修饰生物体。载体进一步可包括编码以下中的至少一者的多核苷酸序列：a)编码标签的序列与编码含有血红素的多肽的序列之间的氨基酸连接子；以及b)编码信号肽的序列与编码含有血红素的多肽的序列之间的氨基酸连接子。一方面，本文提供一种从细菌(例如芽孢杆菌细胞，例如枯草芽孢杆菌本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种能够分泌含有血红素的多肽的重组细菌细胞，所述细胞包含至少一种外源性核酸，所述外源性核酸包含第一和第二核酸序列，其中所述第一核酸序列编码信号肽并且所述第二核酸序列编码含有血红素的多肽，其中所述第一和所述第二核酸序列可操作地连接以产生包含所述信号肽和所述含有血红素的多肽的融合多肽。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.09.11 US 61/876,676;2013.11.25 US 61/908,6891.一种能够分泌含有血红素的多肽的重组细菌细胞，所述细胞包含至少一种外源性核
酸，所述外源性核酸包含第一和第二核酸序列，其中所述第一核酸序列编码信号肽并且所
述第二核酸序列编码含有血红素的多肽，其中所述第一和所述第二核酸序列可操作地连接
以产生包含所述信号肽和所述含有血红素的多肽的融合多肽。
2.根据权利要求1所述的重组细胞，其中所述细胞分泌来自所述细胞的所述含有血红
素的多肽，并且在分泌时，从所述含有血红素的多肽去除所述信号肽。
3.根据权利要求1或2所述的重组细胞，其中所述信号肽包含与以下中阐述的信号肽具
有至少60％一致性的氨基酸序列：SEQIDNO:33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、
57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91或93。
4.根据权利要求1或2所述的重组细胞，其中所述信号肽包含的氨基酸序列与SEQID
NO:55中阐述的氨基酸序列或SEQIDNO:55的残基1-52具有至少60％氨基酸序列一致性。
5.根据权利要求1到4中任一权利要求所述的重组细胞，其中所述含有血红素的多肽选
自由以下组成的群组：雄性球蛋白(androglobin)、细胞球蛋白、球蛋白E、球蛋白X、球蛋白
Y、血红蛋白、肌红蛋白、豆血红蛋白、无脊椎动物血红蛋白、β血红蛋白、α血红蛋白、非共生
血红蛋白、黄素血红蛋白、原球蛋白、蓝藻球蛋白、地狱之门球蛋白I(Hell'sgateglobin
I)、细菌血红蛋白、纤毛虫肌红蛋白、组胺球蛋白、神经球蛋白、原球蛋白以及截短球蛋白。
6.根据权利要求5所述的重组细胞，其中所述截短球蛋白为截短2/2球蛋白、HbN、HbO或
Glb3。
7.根据权利要求1到6中任一权利要求所述的重组细胞，其中所述含有血红素的多肽与
SEQIDNO:1-31中阐述的氨基酸序列具有至少60％序列一致性。
8.根据权利要求1到7中任一权利要求所述的重组细胞，其中所述细胞为芽孢杆菌细胞
(Bacilluscell)。
9.根据权利要求8所述的重组细胞，其中所述芽孢杆菌细胞选自由以下组成的群组：枯
草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)以及地衣芽孢杆
菌(Bacilluslicheniformis)细胞。
10.一种用于制造含有血红素的多肽的方法，所述方法包含在培养基中在允许所述含
有血红素的多肽分泌到所述培养基中的条件下培养重组细菌细胞，所述重组细菌细胞包含
至少一种外源性核酸，所述外源性核酸包含第一和第二核酸序列，其中所述第一核酸序列
编码信号肽并且所述第二核酸序列编码含有血红素的多肽，其中所述第一和所述第二核酸
序列可操作地连接以产生包含所述信号肽和所述含有血红素的多肽的融合多肽，且其中当
所述融合多肽从所述细胞分泌到所述培养基中时，从所述含有血红素的多肽去除所述信号
肽。
11.根据权利要求10所述的方法，其进一步包含从所述培养基回收所述含有血红素的
多肽。
12.根据权利要求10或11所述的方法，其中所述信号肽包含与以下中阐述的信号肽具
有至少60％一致性的氨基酸序列：SEQIDNO:33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、
57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91或93。
13.根据权利要求10到12中任一权利要求所述的方法，其中所述信号肽包含的氨基酸
序列与SEQIDNO:55中阐述的氨基酸序列或SEQIDNO:55的残基1-52具有至少60％氨基
酸序列一致性。
14.根据权利要求10到13中任一权利要求所述的方法，其中所述含有血红素的多肽选
自由以下组成的群组：雄性球蛋白、细胞球蛋白、球蛋白E、球蛋白X、球蛋白Y、血红蛋白、肌
红蛋白、豆血红蛋白、无脊椎动物血红蛋白、β血红蛋白、α血红蛋白、非共生血红蛋白、黄素
血红蛋白、原球蛋白、蓝藻球蛋白、地狱之门球蛋白I、细菌血红蛋白、纤毛虫肌红蛋白、组胺
球蛋白、神经球蛋白、原球蛋白以及截短球蛋白。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述截短球蛋白为截短2/2球蛋白、HbN、HbO或
Glb3。
16.根据权利要求10到15中任一权利要求所述的方法，其中所述含有血红素的多肽与
SEQIDNO:1-31中阐述的氨基酸序列具有至少60％序列一致性。
17.根据权利要求10到16中任一权利要求所述的方法，其中所述细胞为芽孢杆菌细胞。
18.根据权利要求18所述的方法，其中所述芽孢杆菌细胞选自由以下组成的群组：枯草
芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌以及地衣芽孢杆菌细胞。
19.一种产生含有血红素的多肽的重组植物或植物细胞，所述植物包含至少一种编码
含有血红素的多肽的外源性核酸，其中所述植物或植物细胞来自除烟草以外的物种。
20.根据权利要求19所述的植物或植物细胞，所述外源性核酸进一步包含调节控制元
件。
21.根据权利要求20所述的植物或植物细胞，其中所述调节元件为启动子。
22.根据权利要求21所述的植物或植物细胞，其中所述启动子为组织特异性启动子。
23.根据权利要求19到22中任一权利要求所述的植物或植物细胞，其中所述含有血红
素的多肽选自由以下组成的群组：雄性球蛋白、细胞球蛋白、球蛋白E、球蛋白X、球蛋白Y、血
红蛋白、肌红蛋白、豆血红蛋白、无脊椎动物血红蛋白、β血红蛋白、α血红蛋白、非共生血红
蛋白、黄素血红蛋白、原球蛋白、蓝藻球蛋白、地狱之门球蛋白I、细菌血红蛋白、纤毛虫肌红
蛋白、组胺球蛋白、神经球蛋白、原球蛋白以及截短球蛋白。
24.根据权利要求23所述的植物或植物细胞，其中所述截短球蛋白为截短2/2球蛋白、
HbN、HbO或Glb3。
25.根据权利要求19到24中任一权利要求所述的植物或植物细胞，其中所述含有血红
素的多肽与SEQIDNO:1-31中阐述的氨基酸序列具有至少60％序列一致性。
26.根据权利要求19到25中任一权利要求所述的植物或...

【专利技术属性】
技术研发人员：雷切尔·弗雷泽，西蒙·克里斯托弗·戴维斯，帕特里克·欧里利·布朗，
申请(专利权)人：非凡食品有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US