一种弓形虫检测试剂盒制造技术

本发明专利技术提供一种单克隆杂交瘤细胞株4D5，其保藏号是CCTCC NO：C201624，分类命名：杂交瘤细胞株4D5号，保藏日期：2016.2.1。本发明专利技术还提供一种弓形虫检测试剂盒，由试纸条、标准品、对照品、样品稀释液构成，其中试纸条中包被的抗弓形虫SAG3单克隆单体由保藏号是CCTCC NO：C201624的单克隆杂交瘤细胞株4D5分泌。本发明专利技术利用了胶体金免疫层析试纸条技术，该技术检测时间短、成本低、操作简单，适合于现场检测以及流行病学调查。本发明专利技术以弓形虫SAG3为诊断抗原，与SAG1、SAG2相比，其表达量大，并且在弓形虫所有感染阶段都可以表达，更适合作为诊断抗原；临床应用结果显示本发明专利技术敏感性高、特异性强，有较好的稳定性，易于向基层推广。

【技术实现步骤摘要】
一种弓形虫检测试剂盒
本专利技术属于生物技术，涉及一种基于弓形虫表面蛋白3(SAG3)的胶体金免疫层析快速检测技术的检测试剂盒，能够快速检测人、猪、猫、狗等的弓形虫感染。
技术介绍
弓形虫病是一种在世界范围内广泛传播的人兽共患寄生虫病，它是由机会性胞内寄生虫刚地弓形虫所引起的。这种寄生虫可以入侵所有的温血动物，包括人类。免疫力正常的机体不会表现出明显症状，在免疫力低下的人群中会导致脑积水、视网膜脉络膜炎、脑炎，在免疫力系统损伤的人群中甚至会引起死亡。弓形虫病同时也对畜禽养殖业造成了重大的影响，它可以造成畜禽的流产、死胎以及新生幼畜的死亡，尤其是在绵羊和山羊之中。因此，弓形虫病在公共卫生学以及畜禽安全生产上的地位十分重要。弓形虫病的诊断目前主要依靠血清学检测方法，乳胶凝集试验(LAT)是在畜禽中检测弓形虫的主要方法，但该方法的特异性较低。酶联免疫吸附试验(ELISA)是诊断人弓形虫病的最主要方法。但这些方法都需要较长的时间，而且需要一些设备或者受过专业训练的技术人员，不适于大规模现场检测。免疫层析试纸条技术因为其简单，易操作，而且检测时间短，结果易于观察，成本低，易于保存等特点被认为是一种理想的现场检测的方法，对临床检测具有重要意义。弓形虫表面蛋白SAG3是一种保守蛋白，在弓形虫速殖子、缓殖子以及子孢子等多个时期均可表达，并且其表达量较高，仅位于SAG1、SAG2之后；在弓形虫入侵宿主细胞时，大量的SAG3会被释放出来，与SAG1共同发挥粘附及入侵的作用，因此，SAG3是一个非常理想的诊断靶标。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种能分泌抗弓形虫SAG3抗体的单克隆杂交瘤细胞株，该细胞株已被中国典型培养物保藏中心保藏，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏号是CCTCCNO：C201624，分类命名：单克隆杂交瘤细胞株4D5号，保藏日期：2016.2.1。本专利技术的另一个目的是提供一种抗SAG3单克隆抗体，通过以下步骤获得：取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蜡油1mL；7天后每只小鼠腹腔注射1x106个单克隆杂交瘤细胞株4D5，注射后10天开始收集腹水，离心去除杂质，采用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化单克隆抗体，将腹水和醋酸盐缓冲液按1:2的比例混合，搅拌后按照33μl/ml腹水逐滴加入正辛酸，4℃过夜，去除沉淀，冰浴条件下加入饱和硫酸铵溶液，取沉淀溶解，透析过夜，采用Bradford法测得蛋白浓度为6.9mg/ml，其余腹水采用冷冻干燥机冷冻干燥后保存于-80℃冰箱。本专利技术的再一个目的是提供一种弓形虫检测试剂盒，是一种基于弓形虫表面蛋白3(SAG3)的胶体金免疫层析快速检测试纸条的检测试剂盒，采用双抗原夹心法快速检测弓形虫抗原，为防控弓形虫病奠定基础。本专利技术的试剂盒包由试纸条、标准品、对照品、样品稀释液组成；其中试纸条中包被的抗弓形虫SAG3单克隆单体由单克隆杂交瘤细胞4D5(保藏号：CCTCCNO：C201624)分泌，标准品为猪弓形虫阳性血清，对照品为猪弓形虫阴性血清，样品稀释液为10mM、pH7.5的磷酸盐缓冲液(PB)，由NaH2PO4·H2O1.38g，Na2HPO4·12H2O3.58g，加双蒸水定容至100ml，调节pH至7.5。本专利技术试剂盒通过以下步骤制备获得：(1)胶体金溶液的制备：向圆底烧瓶中加入1ml的HAuCl4，迅速加入柠檬酸钠溶液，将水浴温度调至100℃，溶液颜色会在10min内变蓝最后变成酒红色，使溶液自然冷却到50℃，最后置于4℃封存；(2)制备金标蛋白溶液：将胶体金溶液pH调节至8.2，再逐滴加入单克隆抗体4D5，至其终浓度为12.5μg/ml，加入5％的牛血清蛋白溶液(BSA)使其终浓度为1％，继续搅拌振荡30min，之后4℃冰箱静置2h，通过差速离心，收集金标蛋白，用缓冲液溶解4℃保存；(3)试纸条制备：试纸条由PVC板、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫所组成，上端为手持部分，即吸水垫部分；中端为反应区，即硝酸纤维素膜区域，其中C线为质控线，按照2mg/ml包被羊抗鼠IgG，T线为检测线，按照2mg/ml包被抗弓形虫SAG3单克隆抗体，硝酸纤维素膜最佳封闭条件为1h；在硝酸纤维素膜之上放有金标垫，吸附1:5稀释的金标蛋白溶液；下端为样品区(检测孔)，即样品垫区域；将试纸条各部分组装完毕后，在切割机上将试纸条切割成4mm宽的条带，密封保存备用。本专利技术试剂盒的应用：(1)检测程序：将待检血清用样品稀释液稀释，其最佳稀释倍数为1:200，取100μl加入到试纸条下端的样品区中，静置10-15min后观察；(2)结果判定：样品检测的试纸条中，能够清晰的看到T线和C线，线条单一、清楚、背景色浅，则判定样品的检测结果为弓形虫感染阳性；样品检测的试纸条中，未能清晰的看到T线，但C线出现清晰的红色，则判定样品的检测结果为弓形虫感染阴性，T线和C线均未出现红色，则检测结果无效。在所有检测的试纸条上全部能清晰的看到C线的前提下，在阳性标准血清的试纸条上可以看到清晰的红色T线以及红色C线，在阴性标准血清的试纸条上可以看到清晰的C线但看不到T线，并且线条单一、清楚、背景色浅，才可以对样品检测的结果进行判定，否则应重做。本试剂盒检测样品为血清，全血标本请于37℃放置2小时或4℃过夜后于离心机中1000g离心10分钟，取上清检测。本专利技术的有益之处是：本专利技术以弓形虫SAG3为诊断抗原，与SAG1、SAG2相比，其表达量大，并且在弓形虫所有感染阶段都可以表达，更适合作为诊断抗原；本专利技术利用了胶体金免疫层析试纸条技术，该技术检测时间短、成本低、操作简单，适合于现场检测以及流行病学调查；临床应用结果显示本专利技术敏感性高、特异性强，有较好的稳定性，易于向基层推广。附图说明图1是试纸条结构示意图。图2是试纸条结果判定示意图。图3是腹水纯化SDS-PAGE。图4是试纸条特异性检测。图5是试纸条灵敏性检测。图6是试纸条稳定性检测。具体实施方式本技术结合附图和具体实施例作进一步说明，应该理解，这些实例仅用于说明目的，而不用于限制本专利技术范围。实施例一试剂盒制备本专利技术的试剂盒包含：试纸条、标准品、对照品、样品稀释液；其中标准品为猪弓形虫阳性血清，对照品为猪弓形虫阴性血清，样品稀释液为10mM、pH7.5的磷酸盐缓冲液(PB)，由NaH2PO4·H2O1.38g，Na2HPO4·12H2O3.58g，加双蒸水定容至100ml，调节pH至7.5。本专利技术试剂盒通过以下步骤制备获得：(1)抗SAG3单克隆抗体的制备：取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蜡油1mL；7天后每只小鼠腹腔注射1x106个单克隆杂交瘤细胞株4D5(保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCCNO：C201624，保藏日：2016.2.1)，注射后10天开始收集腹水，离心去除杂质，采用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化单克隆抗体，将腹水和醋酸盐缓冲液按1:2的比例混合，搅拌后按照33μl/ml腹水逐滴加入正辛酸，4℃过夜，去除沉淀，冰浴条件下加入饱和硫酸铵溶液，取沉淀溶解，透析过夜，采用Bradford法测定蛋白浓度，结果为6.9mg/ml，其余腹水采用冷冻干燥机冷冻干燥后保存于-80℃冰箱；(2)胶体金溶液的制备：向圆底烧瓶中加入1m本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种单克隆杂交瘤细胞株4D5，其特征在于，该杂交瘤细胞株已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏号是CCTCC NO：C201624，分类命名：杂交瘤细胞株4D5号，保藏日期：2016.2.1。

【技术特征摘要】
1.一种单克隆杂交瘤细胞株4D5，其特征在于，该杂交瘤细胞株已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏号是CCTCCNO：C201624，分类命名：单克隆杂交瘤细胞株4D5号，保藏日期：2016.2.1。2.一种由杂交瘤细胞株4D5分泌的抗SAG3单克隆抗体，所述杂交瘤细胞株4D5的保藏号是CCTCCNO：C201624，其特征在于，通过以下步骤获得：取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蜡油1mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×106个单克隆杂交瘤细胞株4D5，注射后10天开始收集腹水，离心去除杂质，采用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化单克隆抗体，将腹水和醋酸盐缓冲液按1:2的比例混合，搅拌后按照33μl/ml腹水逐滴加入正辛酸，4℃过夜，去除沉淀，冰浴条件下加入饱和硫酸铵溶液，取沉淀溶解，透析过夜，采用Bradford法测得蛋白浓度为6.9mg/ml，其余腹水采用冷冻干燥机冷冻干燥后保存于-80℃冰箱。3.一种弓形虫检测试剂盒，其特征在于，由试纸条、标准品、对照品、样品稀释液组成，其中试纸条中包被的抗弓形虫SAG3单克隆抗体由单克隆杂交瘤细胞株4D5分泌，所述单克隆杂交瘤细胞株4D5的保藏号是CCTCCNO：C201624，标准品为猪弓形虫阳性血清，对照品为猪弓形虫阴性血清，样品稀释液pH为7.5，由NaH2PO4·H2O1.38g，Na2HPO4·12H2O3.58g，加双蒸水定容至100ml制得。4.根据权利要求3所述的一种弓形虫检测试剂盒，...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜爱芳，罗嘉庆，卓洵辉，孙洪超，杨怡，陈学秋，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33