基于表达HBsAg的热失活全重组汉逊酵母细胞的乙肝治疗疫苗，所述疫苗为重组汉逊酵母胞内表达的HBsAg，在108细胞中含有6‑10μg HBsAg为抗原；所述疫苗共含有16‑21个HBsAg特异性CTL(细胞毒T淋巴细胞)表位；所述疫苗以优化的热失活全重组汉逊酵母细胞为佐剂，本发明专利技术提供的疫苗基于汉逊酵母表达系统平台，通过HBsAg特异性CTL细胞靶向感染HBV的肝细胞释放IFN‑γ：第一步非肝细胞损伤地减少其90％以上HBV cccDNA分子池，第二步提高了过程中损毁受感染的肝细胞，并触发HBV免疫逆转。
【技术实现步骤摘要】
[00011本专利技术属基因工程领域，涉及疫苗为热失活全重组汉逊酵母细胞表达HBsAg-adw2 治疗乙肝疫苗。
技术介绍
乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是一个严重的公共卫生问题。据世 界卫生组织(World Health 0ganization，WH0)报道，全球60亿人口中，约20亿人曾感染过 HBV，其中3.5亿人为慢性HBV感染，每年约有100万人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和 原发性肝细胞癌(肝癌）。全球肝癌患者中，75 %以上是由HBV所致。我国属HBV感染地方性流 行区。我国卫生部于1992年将乙型肝炎疫苗纳入计划免疫管理。据2006年全国乙型肝炎血 清流行病学调查表明，经过近15年的努力，我国一般人群，尤其是15岁以下儿童，乙型肝炎 病毒感染率明显下降。，但由于历史原因，据推算我国现在仍有慢性HBV感染者约9300万人， 其中慢性乙型肝炎患者约2000万例。每年因 HBV导致的肝硬化和肝癌死亡30余万例，新发乙 型肝炎病例50万-100万例。乙型肝炎仍是是我国当前和今后相当长时期内危害人民健康、 阻碍社会发展、影响社会稳定的重要因素，是一个严重的公共卫生问题。据调查.我国每年 因慢性乙肝(包括肝硬化、肝癌）的直接和间接医疗费用约6800亿元。如何对现有的乙肝病 毒感染者及乙肝患者进行有效的治疗成为成为乙肝防治工作中需要优先解决的重大问题。 乙肝疫苗免疫预防与治疗是降低疾病负担最有效的方法。基因重组技术是现代生 物技术的核心技术；也是规模化生产乙肝疫苗主要组份：病毒样颗粒乙肝病毒表面抗原 (HBsAg VLP)的唯一技术。酿酒酵母是第一个表达外源基因的真核系统。但由于酿酒酵母表 达系统在工业化生产中仍存在许多不足，如工程菌株的外源基因质粒游离在细胞质中，遗 传不稳定;发酵密度不高，生产效率低;合成的多肽链常过度糖基化等。申请人从1995年开 始从事汉逊酵母重组乙肝疫苗研发工作。1998-2002年在大连高新生物制药有限公司，主持 开发的汉逊酵母重组HBsAg adw2乙肝疫苗，HBsAg VLP抗原纯品（原液)产率为40mg/升；于 2002年起经国家审批上市。2003-2006年本人为北京天坛生物制品股份有限公司协议开发 的重组汉逊酵母HBsAg-adr2乙型肝炎疫苗，其HBsAg VLP抗原纯品（原液)产率为85mg/升以 上；已于2015年申报国家新药审评，以该疫苗为基础申请的中国专利公开号为 CN104232661A。根据现有技术查明的乙型肝炎发病机制如下:人感染HBV后，一般可分为免疫耐受 期、免疫清除期和非活动或低(非)复制期。免疫耐受期的特点是HBV复制活跃，血清HBsAg和 HBeAg阳性，HBV DNA滴度较高（>105拷贝/ml)，血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平正常，肝 组织学无明显异常。免疫清除期表现为血清HBV DNA滴度>105拷贝/ml，但一般低于免疫耐 受期，天门冬氨酸氨基转移酶(AST)持续或间歇升高，肝组织学有坏死炎症等表现。非活动 或低(非)复制期表现为HBeAg阴性，抗-HBe阳性，检测不到(PCR法)或低于检测下限，水平正 常，肝组织学无明显炎症。但在青少年和成人期感染HBV，一般无免疫耐受期，一开始即为免 疫清除期，表现为急性乙型肝炎，其中仅5%-10%发展成慢性。但其确切的发病机制仍不了 解。 抗乙型肝炎病毒治疗是目前对乙肝病毒感染者及乙肝患者的主要治疗手段。目前 抗乙型肝炎病毒药物主要有以干扰素类为主的免疫调节剂和针对HBV DNA多聚酶的核苷酸 类似物两大类，虽有一定疗效，但尚不满意，多数患者不能被治愈。干扰素虽可使少数患者 HBsAg消失或血清学转化，但费用较高，需要注射，且有一定副作用;核苷酸类似物则作用于 HBV DNA聚合酶，只能抑制病毒复制，不能彻底清除HBV DNA和cccDNA，且长期应用易导致病 毒耐药变异。 因此，为了彻底清除肝细胞HBV和cccDNA，亟待开发新的更有效的HBV治疗乙肝疫 苗。人体肝脏为一免疫耐受器官;肝脏移植免疫排斥反应低充分表明这一点。乙型肝炎病毒 (HBV)感染人的部位为肝脏；因此对HBV的免疫耐受为其主要特征。逆转HBV免疫耐受是开发 慢性乙型肝炎患者(CHB)免疫治疗疫苗的立足点。HBV免疫耐受不仅体现在肝脏局部anti-HBV免疫应答不能有效清除病毒，导致持续感染;也体现在HBV持续存在，进而诱导全身性免 疫系统对HBV无应答，如HBV耐受期病人对HBsAg疫苗无应答。这也是当前治疗性疫苗在CHB 病人中难以成功的主要原因。肝脏诱导的免疫耐受及其逆转机制研究将为研制治疗乙肝疫 苗提供了理论依据。 最近的数据表明，初始CD8+T(CTL)细胞活化在肝脏内发生，同时肝脏预先有炎症 (即天然免疫活化)则存活的CTLs增多，CTLs更有效，导致肝脏免疫应答，清除感染的HBV。而 在预先无炎症（即天然免疫未活化，如婴幼儿时）则CTL功能受损和CTL半寿命短，导致肝脏 对HBV免疫耐受。然而，初始HBV抗原相遇免疫诱导高效激活HBV CTLs存在于肝脏外的淋巴 结内，然后再进入肝脏，则也使存活的CTLs增多，CTLs更有效，也导致肝脏免疫应答，清除感 染的HBV。这一关于两个部位的免疫机制为研制皮下、肌肉注射治疗乙肝疫苗，导致肝脏免 疫应答、清除感染的HBV提供了理论依据。 2014年美国 Thomas Η · King报道："A Who 1 e Recomb inant Yeas t-Based Therapeutic Vaccine that is comprised of heat-inactivated,whole recombinant Saccharomyces cerevisiae yeast cells expressing disease-related antigens"；为 一种由热失活、全重组酿酒酵母细胞-表达与疾病相关抗原为基础的治疗性疫苗。该研究开 创了以胞内重组表达蛋白为抗原，以热失活全酿酒酵母细胞为佐剂的治疗性疫苗平台。在 此平台下已有编号为GS4774为乙型肝炎治疗性疫苗，其表达的HBV抗原为一种作为融合蛋 白的x-s-core抗原。这一酵母载体可以提供多种抗原进入MHC I类和II类抗原提呈途径，刺 激强有力的CD4+和CD8+细胞反应，并能打破免疫学小鼠模型中抗原的耐受性。该酵母载体 也不容易在体内被中和，因此适合于重复用药，使之获得长期的免疫压力，理想地清除慢性 细胞内感染，如HCV和HBV。 2010年Huang报道：啤酒酵母细胞壁纯化而得的β-葡聚糖颗粒(GPS)，其中具有1， 3-D-glucan聚合物>85%，2%甲壳素，1%脂类和蛋白质，与其余的大部分是灰和水分。进行 的体外T细胞增殖实验中，将卵清蛋白（0VA)复合至空心GPS壳内（GP-0VA)组成的疫苗，并采 用游离0VA为对照抗原。GPS-0VA在从0.03到0.5μ克/毫升的浓度范围内，刺激0Τ-Ι或0Τ-ΙΙ Τ细胞增殖;相反，游离0VA未能刺激0Τ-Ι或0Τ-ΙΙ Τ细胞性增殖。为了实现GP-0VA相似的刺 本文档来自技高网...
【技术保护点】
基于表达HBsAg的热失活全重组汉逊酵母细胞的乙肝治疗疫苗，其特征在于所述的乙肝治疗疫苗以所述热失活全重组汉逊酵母细胞作为佐剂，作为抗原的HBsAg在所述重组汉逊酵母细胞内表达量为每108细胞中含有6‑10μg HBsAg；所述HBsAg共含有16‑21个HBsAg特异性CTL表位。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：汪和睦，王昌华，杨珺，
申请(专利权)人：汪和睦，
类型：发明
国别省市：天津;12
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。