甲型流感病毒的测定方法技术

本发明专利技术公开了甲型流感病毒的测定方法，该方法是通过使用与广泛的亚型反应性高的抗甲型流感病毒单克隆抗体进行免疫测定。该方法包括通过利用下述抗原抗体反应的免疫测定来测定甲型流感病毒：与甲型流感病毒的基质蛋白(M1)特异性反应的单克隆抗体或其抗原结合性片段与检样中的甲型流感病毒的抗原抗体反应。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】甲型流感病毒的测定方法
本专利技术涉及甲型流感病毒的测定方法以及其中所使用的免疫测定器具和单克隆抗体。
技术介绍
流感是在冬季流行的传染病，呈现高烧、上呼吸道感染、倦怠感等临床症状，但仅凭这些症状并不容易与腺病毒、RS病毒、副流感病毒、人偏肺病毒(humanmetapneumovirus)等其它病毒引起的传染病区别。流感的确诊方法有病毒分离、血清学诊断、核酸检测(PCR法)等，但这些方法并不能在诊疗室等日常的医疗现场简便进行，因此人们需求更简便的诊断方法。近年来，人们开发了兼具简便性和迅速性、以免疫层析法为原理的抗原检测试剂，广泛应用于辅助诊断。流感病毒是以节段状的负链RNA作为基因组基因的病毒，由HA、NA、PA、PB1、PB2、M、NP、NS的8个节段构成。根据所构成的蛋白质中的基质蛋白(M1)和核蛋白(NP)的抗原性的不同，流感病毒被分类为甲型、乙型和丙型。该蛋白质的抗原性各有不同，因此不会在不同的型之间显示交叉反应。甲型流感病毒的M节段中有M1和M2两种不同的基因被编码，分别由它们合成结构蛋白。这些蛋白质相当于乙型流感病毒的M1和BM2，但甲型的M2与乙型的BM2结构有很大不同。M1是以增强病毒包膜的内侧的形式局部存在，可以认为这实质上起到了壳的作用。作为流感的治疗药物，使用磷酸奥塞米韦(OseltamivirPhosphate)、扎那米韦水合物(ZanamivirHydrate)、培拉米韦水合物(PeramivirHydrate)、辛酸拉尼米韦水合物(LaninamiviroctanoateHydrate)、盐酸金刚烷胺(AmantadineHydrochloride)，而作为M2抑制剂的盐酸金刚烷胺并不抑制乙型流感病毒的感染增殖，因此只用于甲型流感的治疗。并且有人指出：前4者是作为神经氨酸酶(NA)抑制剂显示同一作用点的治疗药物，但根据流感类型的不同，解热时间或病毒残留率等的有效性有差异(非专利文献2)。因此，为了之后的适当的治疗药物选择，流感类型的鉴别是很重要的。即使是甲型流感病毒之间，根据血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的抗原性的不同，也被分类为多种亚型。目前报告有16种HA、9种NA，它们的组合成为宿主动物种类受到限定的原因，作为人的流感病因而已知的除H1N1、H3N2、H1N2、H2N2四种之外，如H5N1或H7N9这样，自其它动物宿主对人传染偶有发生。在以往的免疫测定器具中确认了对各亚型的反应，但是其反应性并不一致，也存在低反应性的亚型。以往的流感的检测特别使用了抗NP抗体(专利文献1-3)、抗M2抗体(专利文献4)等。还有将与M1发生抗原抗体反应的抗M1抗体用于研究的报告(非专利文献3和4)等，但未应用于以辅助诊断为目的的免疫测定器具。现有技术文献专利文献专利文献1：日本特开2007-285749专利文献2：日本特许4936428号公报专利文献3：WO2005/007698专利文献4：日本特许4932940号公报非专利文献非专利文献1：ウイルス第56卷第1号，pp.109-116，2006非专利文献2：JInfect.2008Jan;56(1):51-7.Epub2007Oct15.(AcomparisonoftheeffectivenessofzanamivirandoseltamivirforthetreatmentofinfluenzaAandB.(扎那米韦和奥塞米韦对治疗甲型和乙型流感的效果比较))非专利文献3：JournalofImmunologicalMethods第387卷,第1-2期,2013年1月31日,43-50页(Preparationofmonoclonalantibodiesagainstpoorimmunogenicavianinfluenzavirusproteins(低免疫原性禽流感病毒蛋白的单克隆抗体的制备))非专利文献4：VirusGenes.1989Nov;3(2):111-26.(Monoclonalantibodyanalysisofinfluenzavirusmatrixproteinepitopesinvolvedintranscriptioninhibition.(流感病毒基质蛋白的转录抑制相关表位的单克隆抗体分析))。
技术实现思路
专利技术所要解决的课题以往的免疫测定方法中使用抗NP单克隆抗体等，但根据甲型流感病毒的亚型不同，反应性较低。本专利技术的目的是提供甲型流感病毒的测定方法，该方法通过使用对广范围的亚型反应性高的抗甲型流感病毒单克隆抗体的免疫测定进行。本专利技术的目的还提供上述本专利技术的方法中使用的免疫测定器具和单克隆抗体。解决课题的方案本专利技术人进行了深入的研究，结果成功地制作了：以甲型流感病毒的M1为抗原且与甲型流感病毒特异性反应的抗甲型流感病毒单克隆抗体，并进一步发现，通过使用该单克隆抗体来免疫测定甲型流感病毒，也可以测定在以往的使用抗NP单克隆抗体的免疫测定中难以检出的甲型流感病毒亚型，从而完成了本专利技术。即，本专利技术提供甲型流感病毒的测定方法，该测定方法包括通过利用下述抗原抗体反应的免疫测定来测定甲型流感病毒：与甲型流感病毒的基质蛋白(M1)特异性反应的单克隆抗体或其抗原结合性片段与检样中的甲型流感病毒的抗原抗体反应。本专利技术还提供免疫测定器具，该免疫测定器具具备：第1抗体或其抗原结合性片段固定于支撑物上的检测区域、将第2抗体或其抗原结合性片段与检样一起供给的标记物区域和检样移动区域，其中，所述第1抗体和第2抗体的至少一方是与甲型流感病毒的基质蛋白(M1)特异性反应的单克隆抗体。本专利技术进一步提供与甲型流感病毒的基质蛋白(M1)特异性反应的单克隆抗体或其抗原结合性片段。专利技术效果根据本专利技术的方法，可以免疫测定广范围的亚型的甲型流感病毒。根据本专利技术，还提供用于上述本专利技术的方法的新的免疫测定器具和单克隆抗体。附图简述图1是示意性表示本专利技术的免疫层析免疫测定器具的1个优选方案的图。图2是表示通过蛋白质印迹法研究下述实施例中制备的本专利技术的单克隆抗体反应性的结果的图。图3是表示研究下述实施例中制备的本专利技术的单克隆抗体的反应性的肽阵列分析结果的图。图4是表示甲型流感病毒各亚型的M1的C末端一侧的氨基酸序列、和下述实施例中制备的本专利技术的单克隆抗体所结合的区域的图。实施方明的方案本专利技术的单克隆抗体与甲型流感病毒M1(以下简称为A-M1)发生抗原抗体反应。A-M1是由252个氨基酸残基构成的蛋白质，通过在蛋白质印迹法的检测中使用该抗体，可以探测与分子量20-35kD发生抗原抗体反应而产生的特异性信号。本说明书中“特异性”是指在蛋白质与该抗体混合的液体系统中，该抗体不会以可检出的水平与A-M1以外的蛋白质成分发生抗原抗体反应，或者即使发生任何结合反应或缔合反应，也只会发生比该抗体与A-M1的抗原抗体反应明显弱的反应。优选的方案中，本专利技术的单克隆抗体与A-M1氨基酸序列的第127-252号的氨基酸区域反应。A-M1氨基酸序列是公知的，例如记载于GenBank：ACD37490等(SEQIDNO:1)。图4示出各亚型A-M1氨基酸序列中的第127-252号的氨基酸序列的并列比较。更优选本专利技术的单克隆抗体与A-M1氨基酸序列的第173-186号氨基酸区本文档来自技高网...

【技术保护点】
甲型流感病毒的测定方法，该方法包括通过利用下述抗原抗体反应的免疫测定来测定甲型流感病毒：与甲型流感病毒的基质蛋白(M1)特异性反应的单克隆抗体或其抗原结合性片段与检样中的甲型流感病毒的抗原抗体反应。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.09.10 JP 2013-1871411.甲型流感病毒的测定方法，该方法包括通过利用下述抗原抗体反应的免疫测定来测定甲型流感病毒：与甲型流感病毒的基质蛋白M1的第173-186号氨基酸区域特异性反应的单克隆抗体或其抗原结合性片段、和与甲型流感病毒的基质蛋白M1的第232-241号氨基酸区域特异性反应的第2单克隆抗体或其抗原结合性片段，与检样中的甲型流感病毒的抗原抗体反应。2.权利要求1所述的方法，其中，所述单克隆抗体与甲型流感病毒的下述各亚型病毒发生抗原抗体反应：H1N1、H1N2、H2N2、H2N3、H3N2、H3N8、H4N6、H5N1、H5N2、H6N2、H7N1、H7N7、H7N9、H8N4、H9N2、H10N7、H11N6、H12N5、H13N6、H14N5、H15N8和H16N3。3.权利要求1或2所述的方法，其中，所述免疫测定是夹层法。4.权利要求3所述的方法，其中，所述免疫测定是免疫层析法。5.权利要求1所述的方法，其中，该方法使用下述两者的混合物：与甲型流感病毒的基质蛋白M1特异性反应的单克隆抗体或其抗原结合...

【专利技术属性】
技术研发人员：稻野浩一，宫泽恭，石川治，
申请(专利权)人：电化生研株式会社，
类型：发明
国别省市：日本;JP