一种马铃薯转基因成分的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种马铃薯转基因成分的检测方法，属于生物技术领域。所述方法包括：确定转基因成分、内源标准基因和外源标准基因；制备多重扩增引物；进行抽样并混合，得到混合样品；提取混合样品的基因组并加入外源标准基因，得到混合核酸；构建高通量测序文库；对高通量测序文库进行高通量测序，得到测序片段组；获得待测样品中转基因成分的测序片段的数量、内源标准基因的测序片段的数量和外源标准基因的测序片段的数量；根据外源标准基因的测序片段的数量，判断实验是否成功并计算待测样品种中转基因成分的含量；根据转基因成分的含量判断待测样品中是否含有转基因成分。该方法能够同时定量检测待测样品中的任意多种转基因成分。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术设及生物检测领域，特别设及一种马铃馨转基因成分的检测方法。
技术介绍
马铃馨是我国主要作物，马铃馨的转基因技术已成熟，需要对转基因马铃馨的推 广进行监管，转基因成分检测是转基因监管的技术支撑。 现有的转基因成分检测技术主要检测核酸或蛋白质，其中，基于核酸的检测方法 主要流程为：提取待测样品中的核酸，利用PCR^olymerase化ainReaction，聚合酶链反应） 的方法扩增样品中的转基因成分，利用实时定量、琼脂糖电泳或忍片技术检测转基因成分 是否存在。 在实现本专利技术的过程中，专利技术人发现现有技术至少存在W下问题中的一种： 转基因成分多种多样，而现有技术一次只能检测其中一种或少数几种，因此，需要 对可能的多种转基因成份逐一进行检测，才能确定为"非转基因"产品；一般检测的是共转 化的转基因成分，而不是外源基因本身，因此，对于无标记转基因来说，采用现有的检测方 法进行检测会失效;检测基本上是定性检测，但定量检测又有其现实需求，例如，少量转基 因马铃馨品种混入非转基因品种中，在定性检测时，非转基因品种将被误判为转基因品种， 可能产生错误的法院判决或行政处罚。
技术实现思路
为了解决现有技术的问题，本专利技术实施例提供了一种马铃馨转基因成分的检测方 法。所述技术方案如下： 本专利技术实施例提供了一种马铃馨转基因成分的检测方法，所述方法包括：[000引确定待测样品中需要检测的转基因成分、所述待测样品中的内源标准基因和所述 待测样品的外源标准基因，所述待测样品为马铃馨植株或马铃馨植株的一部分； 制备用于扩增所述转基因成分、所述内源标准基因和所述外源标准基因的测试区 域的多重扩增引物； 对所述待测样品进行抽样并混合，得到混合样品； 提取所述混合样品的基因组； 向所述混合样品的基因组中加入所述外源标准基因，得到混合核酸； 利用所述多重扩增引物对所述混合核酸进行扩增，得到扩增产物，利用所述扩增 产物构建高通量测序文库； 对所述高通量测序文库进行高通量测序，得到测序片段组； 分析所述测序片段组，获得所述待测样品中所述转基因成分的测序片段的数量、 所述内源标准基因的测序片段的数量和所述外源标准基因的测序片段的数量； 根据所述外源标准基因的测序片段的数量，判断实验是否成功； 若所述实验成功，则计算所述待测样品种中所述转基因成分的含量； 根据所述转基因成分的含量判断所述待测样品中是否含有转基因成分。 具体地，所述转基因成分为外源功能基因、抗性标记基因、启动子、终止子和外源 插入旁侧序列中的至少一种。 具体地，所述内源标准基因为所述待测样品的基因组中的单拷贝基因。具体地，所述外源标准基因不存在于所有生物中。 具体地，所述判断实验是否成功的方法为：当所述外源标准基因的测序片段的数 量和所述内源标准基因的测序片段的数量均含α1时，则实验成功；当所述外源标准基因的 测序片段的数量或所述内源标准基因的测序片段的数量<α1时，则实验失败;其中，α1为判 定阔值。 具体地，所述判定所述待测样品是否含有转基因成分的方法为：当需要检测的任 意一种所述转基因成分的含量含02时，判定所述待测样品含有转基因成分；当所有所述转 基因成分的含量如2时，判定所述待测样品不含有转基因成分;其中，α2为判定阔值。 具体地，计算所述待测样品种中所述转基因成分的含量的方法为:第m种所述转基 因成分的含量的计算公式为其中，i为所述第m种转基因成分的 第i个测试区域，nl为所述第m种转基因成分的所述测试区域的个数，bi为所述第m种转基因 成分的第i个所述测试区域的所述测序片段的数量，k为第k种所述内源标准基因，n3为所述 内源标准基因的个数，j为第k种所述内源标准基因的第j个测试区域，n2为所述第k种内源 标准基因的所述测试区域的个数，aj为所述第k种内源标准基因的第巧巾所述测试区域的所 述测序片段的数量;N为所有所述内源标准基因的所述测试区域的总数。 具体地，所述外源标准基因的质量与所述混合样品的基因组的总质量的比例大于 1/100000。 本专利技术实施例提供的技术方案带来的有益效果是:本专利技术提供的检测方法可W在 不同待测样品、不同检测的目标基因间通用，可W-次性检测任意多种需要检测的转基因 成分，从而判定待测样品是否含有转基因成分，该方法可W实现定量检测，且检测结果几乎 没有下限，结果准确可靠，是现有技术达不到的。【具体实施方式】 为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本专利技术实施方式作进一 步地详细描述。本专利技术实施例中未注明或详细描述的操作流程或操作规范均为普通分子生 物学技术人员所熟知的操作。本专利技术实施例中未注明的试剂或生物材料均为市场上销售的 常用试剂或生物材料，均为普通分子生物学技术人员所熟知的，且可W在市场上购买到。 [002引实施例通过农杆菌介导法将双丙氨酷憐抗性(Biolaphos resistance，Ba;r)基因导入天 馨9号马铃馨品种，自交纯化3代后，获得改造的天馨9号马铃馨品种，作为本实施例的待测 马铃馨品种。其中，天馨9号马铃馨是转基因马铃馨受体品种，由天水市农业科学研究所中 梁试验站育成，本实施例中使用的天馨9号马铃馨块茎由江汉大学保存和繁殖。马铃馨转基因成分检测方法，具体步骤如下： 步骤1、确定待测样品中需要检测的转基因成分、待测样品中的内源标准基因和待 测样品的外源标准基因，具体方法如下:待测样品为马铃馨植株或马铃馨植株的一部分，其 中，马铃馨植株可W为马铃馨植株的根、茎、叶、花、果实或种子等器官，也可W是巧巾及巧中 W上的不同器官的混合物，如叶和茎的混合物，马铃馨植株的一部分可W为马铃馨植株的 根、茎、叶、花、果实和种子等至少一个器官中的一部分。在本实施例中，待测样品为改造后 的天馨9号马铃馨的叶片，转基因成分、内源标准基因和外源标准基因均含1个，转基因成分 可W为外源功能基因、抗性标记基因、启动子、终止子和外源插入旁侧序列中的至少一种， 即通过转基因技术手段向天馨9号马铃馨品种中转入不存在于天馨9号马铃馨品种中的外 源核酸序列；内源标准基因为待测样品的基因组中的单拷贝基因。在本实施例中，内源标准 基因通过NCBKht化://www.ncbi .nlm.nih. gov/)在待测样品基因组上比对时为单一序列； 外源标准基因不存在于所有生物中，在本实施例中，所使用的外源标准基因为邸CC04基因， 其在NCBI上同源比对时，未发现同源序列，可W判定外源标准基因不存在于所有生物中。在 本实施例中，检测的转基因成分共5种，内源标准基因1种，外源标准基因1种，其相关信息见 表1，表1中所列转基因成分不仅包括Bar基因，其为外源功能基因，还包括其他转基因成分， 运些转基因成分在转基因作物中广泛使用，因此，本实施例提供的检测方法具有通用性。表 1中的基因序列有两种表示方式，一种是直接写出基因序列，另一种是NBCI的基因编号，表1 中的测序区域中的数字代表碱基的位置，该基因的第1个碱基的位置定义为1。 表1为实施例一中被检测基因的相关信息与检测结果 表1中'7'表示无。 步骤2、制备用于扩增转基因成分、内源标准基因和外源标准基因的多重扩增引 物，具体方法如下：...

【技术保护点】
一种马铃薯转基因成分的检测方法，其特征在于，所述方法包括：确定待测样品中需要检测的转基因成分、所述待测样品中的内源标准基因和所述待测样品的外源标准基因，所述待测样品为马铃薯植株或马铃薯植株的一部分；制备用于扩增所述转基因成分、所述内源标准基因和所述外源标准基因的测试区域的多重扩增引物；对所述待测样品进行抽样并混合，得到混合样品；提取所述混合样品的基因组；向所述混合样品的基因组中加入所述外源标准基因，得到混合核酸；利用所述多重扩增引物对所述混合核酸进行扩增，得到扩增产物，利用所述扩增产物构建高通量测序文库；对所述高通量测序文库进行高通量测序，得到测序片段组；分析所述测序片段组，获得所述待测样品中所述转基因成分的测序片段的数量、所述内源标准基因的测序片段的数量和所述外源标准基因的测序片段的数量；根据所述外源标准基因的测序片段的数量，判断实验是否成功；若所述实验成功，则计算所述待测样品种中所述转基因成分的含量；根据所述转基因成分的含量判断所述待测样品中是否含有转基因成分。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李甜甜，彭海，高利芬，张静，
申请(专利权)人：江汉大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42