本发明专利技术属于家畜分子标记制备技术领域，具体涉及水牛产奶性状相关的Leptin基因G3683T位点作为分子标记在水牛泌乳性能研究上的应用。特征是Leptin基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其中第3683处有一个G/T碱基突变，该位点与水牛品种的产奶量显著相关(P<0.05)。本发明专利技术公开了检测序列表SEQ ID NO：1的第3683处G/T碱基突变所需的上下游引物序列。本发明专利技术为水牛产奶性状标记提供了一种新的分子标记方法。
【技术实现步骤摘要】
【专利说明】水牛泌乳相关基因 Lept i η作为分子标巧的方法及其应用
本专利技术属于家畜分子标记制备
，具体设及一种水牛产奶性状基因 Leptin 作为分子标记的方法及其应用。 【
技术介绍
】 水牛是我国南方特有的种畜资源，而较低的产奶量和繁殖性能已成为了影响其产 业发展的两大科学问题。显然，利用先进的分子标记技术应用于优良奶水牛种质资源的选 育将会有效的提高选种效率。 产奶性状是奶水牛的一个重要经济性状，由多种微效基因决定，是一种典型的由 多基因控制的数量性状。克隆奶水牛泌乳性能相关基因并探讨其遗传特性，W提高奶水牛 生产性能，为选育具有高产奶量的优良的奶水牛品种提供技术支撑和奠定理论基础。 Leptin基因又称肥胖基因，编码蛋白质为瘦素，由脂肪细胞分泌，可控制哺乳动物 的采食量和体组成，对动物的生长、繁殖和泌乳性能具有重要作用。近些年，Leptin基因一 直受到畜牧研究者的重视，尤其在探究Leptin基因与家畜重要经济性状间的相关性做出了 大量的分析。Konfodov等（1999)率先从22头牛L邱tin基因中筛查出20个单核巧酸多态性 位点（Single Nuclease Polymo巧hism，SNP)，其中每89bp就存在一个SNP位点，且有6个SNP 位于外显子上。随后，Yoon等(2005)对24头韩国牛Leptin基因的多态性进行筛查，共发现57 个SNPs，其中有14个位于5'侧翼区，27个在内含子上，8个在外显子区域，其余8个位于3'侧 翼区。研究表明Leptin基因的多态性分布于不同的家畜中且与不同的生产性状具有关联 性，如Leptin基因口 3T位点突变与成牛禍体脂肪沉积增多有关，Leptin基因的SNP位点A80V 对牛的不返情率影响显著，Leptin-1238中G相对于C来说显著降低了牛的乳脂率和乳蛋白 率等。显然，根据LEP基因功能，该基因可作为影响水牛产奶性状的候选基因，用于分子标记 的开发和利用，为建立分子标记辅助选择技术奠定基础。而且，迄今为止，尚无有关水牛 Leptin基因作为水牛产奶性状的分子标记研究报道。 【
技术实现思路
】 本专利技术提供了一种水牛产奶性状相关基因 Leptin作为分子标记的方法，该分子标 记的方法是通过PCR-DNA测序与高分辨率溶解曲线化RM)技术完成的。 水牛产奶性状基因 Leptin的基因片段的核巧酸序列如SEQ ID NO: 1所示，其中第 3683处有一个G/T单碱基突变，该位点与水牛品种的产奶量显著相关(P<0.05)。 进一步提供一种检测序列SEQ N0:1第3683bp处G/T碱基突变的正反向引物对的 DNA序列如下所示：[000引 正向引物：5-GTGGTCTTGCTCATCAGGAAG-3，SEQ NO:2 反向引物：5-TGTCTGCTGTTATGGTCTTAGG-3，SEQ NO:3 本专利技术水牛产奶性状L邱tin基因 G3683T处SNP位点的获取方法，包括如下步骤： (1)待测水牛基因组DNA提取； (2)目的片段扩增及测序：随机50头水牛基因组DM进行混池，w作为PCR反应模 板，利用SEQ N0:2-3引物进行PCR技术扩增，获得的扩增产物委托深圳华大科技有限公司进 行测序，利用DNAStar T.OSeqman生物信息分析软件对测序结果进行比对，获取候选的 Leptin基因 SNP位点； (3)基因分型：针对360头水牛基因组DNA样本，利用高分辨率溶解曲线化RM)技术 进行候选SNP位点的分型，得出各样本位点的基因型； (4)关联分析:利用SAS软件GLM程序对水牛个体的SNP分型结果W及产奶量数据进 行数据分析，获得与水牛产奶量显著相关的分子标记。 本专利技术水牛产奶性状基因 Leptin作为分子标记的应用，具体步骤如下： (1)对待选育水牛进行静脉采集提取总DNA; (2)针对核巧酸序列沈Q ID N0:1的第3683bp处的G3683-T3683 SNP位点，采用高 分辨率溶解曲线化RM)技术检测上述步骤（1)中所述的DNA样本进行基因分型，得出GT基因 型的水牛作为本专利技术所需的选育奶水牛。本专利技术为水牛分子标记辅助育种提供了新的分子 标记。 所述的分子标记为水牛产奶性状的遗传标记。 所述的应用为奶水牛的早期选育。 该水牛产奶性状相关基因 Leptin作为分子标记的方法及其应用。综上所述，由于采用了上述技术方案，本专利技术的有益效果是： 1、提供了一种水牛泌乳相关基因 Leptin作为分子标记方法； 2、为提高奶水牛产奶量生产性能，选育具有高产奶量的优良的奶水牛品种提供技 术支撑和奠定理论基础。 对本专利技术更详细描述可参见实例部分。 【【附图说明】】 图1为SNP分型结果展示。 【【具体实施方式】】 下面的实施例可W帮助本领域的技术人员更全面地理解本专利技术，但不可任何 方式限制本专利技术。 实施例1:水牛基因组总DNA的制备[002引采用血液基因组DNA提取试剂盒制备水牛基因组总DNA(天根，北京），具体操作步 骤如下： 1、取全血500化置于1 . 5mL离屯、管，加入等体积的细胞裂解液化，颠倒混匀， 1200化pm离屯、Imin，吸取上清，留下沉淀;加入等体积的细胞裂解液化，重复此步骤一次;加 入化L RNAase(100mg/mL)，振荡 15sec，室溫静置5min; 2、加入20化Proteinase K溶液，混匀，加入20化L缓冲液GB，充分颠倒混匀，56°C 放置lOmin，期间颠倒混匀数次，溶液应变清亮； 3、加入2(K)yL无水乙醇，充分颠倒混匀;此时可能会出现絮状沉淀； 4、将上述所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱CB3放入收集管 中），12，000巧m离屯、Imin，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中； 5、向吸附柱CB3中加入500化缓冲液GD，12，OOOrpm离屯、Imin，倒掉收集管中的废 液，将吸附柱CB3放入收集管中； 6、向吸附柱CB3中加入600化漂洗液PW，12，00化pm离屯、Imin，倒掉收集管中的废 液，将吸附柱CB3放入收集管中；重复此操作一次； 7、12,00化pm离屯、2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室溫放置数分钟，W彻底惊干 吸附材料中残余的漂洗液； 8、将吸附柱CB3转入1.5mL离屯、管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50-200化洗脱缓 冲液TB，室溫放置2-5min，12，000巧m离屯、2min，将溶液收集到离屯、管中； 9、存放于-20°C冰箱中保存备用。 实施例2:水牛产奶性状Leptin基因分子标记的获取 1、引物设计：WSEQ NO: 1为模板，利用Primers . 0引物设计软件，经01 igo软件检 巧。，确定用于扩增水牛Leptin基因的正方向引物，并委托大连宝生物技术有限公司合成，其 中用于扩增所述基因的正反向引物的DNA序列如SEQ ID N0:2-3所示。 2、PCR扩增反应 随机选择50头水牛基因组DNA样本进行混池，W作为PCR反应的模板。 (l)PCR反应:反应总体积为40yL，其中水牛DNA混合池模板化L，10X LA Taq Mix20 化，引物混合物（1〇本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种水牛产奶性状相关基因Leptin作为分子标记的方法，其特征在于，该分子标记的方法是通过PCR‑DNA测序与高分辨率溶解曲线(HRM)技术完成。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：庞春英，邓廷贤，梁贤威，陆杏蓉，朱鹏，段安琴，
申请(专利权)人：广西壮族自治区水牛研究所，
类型：发明
国别省市：广西;45
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。