一种玉米小斑病病原物的快速检测方法技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，涉及一种特异性引物快速检测病原物的方法，具体涉及一种快速检测玉米小斑病的特异性引物及其检测方法。一种玉米小斑病病原物的快速检测方法，包括（1）真菌菌丝的收集；（2）真菌DNA的提取；（3）PCR扩增：PCR反应体系为，正向引物X-EF和反向引物X-ER各1μL，DNA模板1μL，Taq PCR Master Mix 12.5μL，ddH2O补至25μL；PCR反应程序为94℃预变性3min；94℃变性30s、52.9℃退火30s、72℃延伸30s，共32个循环；72℃延伸10min，4℃保存。为从玉米叶片中快速、准确监测玉蜀黍平脐蠕孢菌潜伏侵染与否提供依据，有利于及早有效的采取防治措施。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程
，设及一种特异性引物快速检测病原物的方法，具 体设及一种快速检测玉米小斑病的特异性引物及其检测方法。
技术介绍
玉米小斑病菌为半知菌类、平厮蠕抱菌属、玉蜀泰平厮蠕抱菌，学名为:Bipolaris maydis(Nisikadoe Τ Miyake)Shoem，异名为：Helminthosporium maydis Nisikadoe TMiyake，Drechslera maydis(Nisikado et Miyake)Subram&Jain。有性态为异旋抱腔菌 Cochl iobolus heterostrophus(Drechsler)Drechsler，异名为：0phiobolus Heterostro地us Drechsler。该菌子囊座呈黑色，近球形，357-642 X 276-443(皿），子囊顶 端纯圆，基部具短柄，大小124-183Χ23-29(μπι)。每个子囊内的子囊抱子数目不等，一般为 Ξ个左右，子囊抱子呈长线形，约7.3 X 6.3-8.8(μπι)大小。无性态的分生抱子梗散生在病叶 上的病斑两侧，从表皮细胞或叶片组织的气孔伸出，单生或者束生，揽褐色至褐色，伸直或 弯曲，基部细胞大，顶端略细且颜色较浅，下部色深较粗，抱痕明显，生在顶点或折点上，一 般有6至8个隔膜，大小80~156X5~10(μπι)。分生抱子从抱子梗的顶端或侧方生出，长楠圆 形，多弯向一侧具隔，厮点平截。 该病原菌能够引起玉米小斑病，是广泛发生于玉米产区的一种较为严重的叶部病 害。二十世纪20年代我国著名植物病理学家俞大级在江浙地区发现此病，并于1933年对该 病进行了详细深入的报道。上世纪70年代美国玉米小斑病大流行W来，玉米小斑病在世界 各国玉米产区都有发生，成为玉米上主要病害之一，每年都会造成一定的产量损失。因此， 尽早快速的检测该病原菌对减轻该病害造成的损失具有重要的意义。目前平厮蠕抱类病菌 的分类和鉴定主要基于形态学特征、致病性测定等。传统的病菌鉴别方法耗时长、灵敏度低 W及经验性强，发病植株中分离并鉴定病原菌需要数天时间，难W做到对病害发生的及时 监测和有效控制病原菌的传播与病害流行。随着分子生物学的发展，不同分子技术用于植 物蠕抱类病害的检测。通过比对所测序的玉蜀泰平厮蠕抱菌与GenBank中平厮蠕抱属中其 它几个种的EF-la基因的部分序列，利用DNAMAN设计出了可用于检测玉蜀泰平厮蠕抱菌的 特异性引物，为从玉米叶片中快速、准确监测玉蜀泰平厮蠕抱菌潜伏侵染与否奠定了基础， 有利于及早有效的采取防治措施。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是：玉米小斑病菌能够引起玉米小斑病，是广泛发生于 玉米产区的一种较为严重的叶部病害，每年都会造成一定的产量损失。因此，尽早快速的检 测该病原菌对减轻该病害造成的损失具有重要的意义，本专利技术提供一种快速检测玉米小斑 病的特异性引物及使用方法。 本专利技术的技术方案是： -种玉米小斑病病原物的快速检测方法，所述检测方法包括W下步骤： (1)真菌菌丝的收集；[000引（2)真菌DNA的提取； (3)PCR扩增：PCR反应体系为，正向引物X-EF和反向引物X-ER各化L，DNA模板化L， Taq PCR Master Mix 12.扣L，d地2〇补至反应程序为94°C预变性3min;94°C变性 30s、52.9°C 退火 30s、72°C 延伸 30s，共 32 个循环;72°C 延伸 lOmin，4°C 保存。 所述正向引物《-6尸序列如沈9 10^:1所示，反向引物乂斗3序列如沈9 10^:2所 /J、- 〇 所述正向引物和反向引物的浓度为扣molAiL，DNA模板浓度为25ngAiL，Taq PCR Master Mix购自上海莱枫生物科技有限公司，所述Taq PCR Master Mix含有0.化/μL Taq DNA polymerase，0.4mM each dNTP，2XTaq Buffer,PCR增强剂和蛋白质稳定剂。 一种玉米小斑病的快速检测方法作为玉米叶片中小斑病病原菌早期监测的应用。 本专利技术的有益效果是:为从玉米叶片中快速、准确监测玉蜀泰平厮蠕抱菌潜伏侵 染与否提供依据，有利于及早有效的采取防治措施。【附图说明】 图1为玉米小斑病单重PCR引物特异性检测图，其中1: (ZM09358)，2: (ZM10094-2)， 3：(ZM10233-3),4：(09316-5),5：(ZM09313-2-1),6：(ZM10321),7：(ZM10599),8：(ZMLC025- 2),9：(ZM10322-3),10：(ZM10587-2),11：(ZTY030032),12：(ZM10239-1),13：(ZM09362-2), 14:(DH020637)，15:(ZM10601)，16:(ZM10602)，17:(ZM10603)，18:(ZM10604)，19: (ZM10605)，CK:空白对照，Μ: DL2000Marker;[001引图2为玉米小斑病引物灵敏度的检测图，其中Μ为分子标量DL1000;CK为阴性对照； 泳道 1-12 分别是在 25化的体系中含有 long、Ing、lOOpg、lOpg、Ipg、lOOfg、lOfg、Ifg、lOOag、 10ag、lag、0.1ag DNA量的扩增结果； 图3为玉米发病叶片的检测，Μ为分子标量化2000的marker ;CK为阴性对照；泳道1 为健康的玉米叶片提取DNA扩增结果;泳道2为发病玉米叶片提取DNA扩增结果;泳道3为阳 性对照。【具体实施方式】 -种玉米小斑病病原物的快速检测方法，所述检测方法包括W下步骤：[001引（1)真菌菌丝的收集； (2)真菌DNA的提取； (3)PCR 扩增反应。 所述正向引物X-EF序列如沈QIDN0:1所示，反向引物X-ER序列如沈QIDN0:2所 /J、- 〇 一种玉米小斑病的快速检测方法作为玉米叶片中小斑病病原菌早期监测的应用， 具体步骤如下： -、真菌菌丝的收集 取保存的菌株(见附表一)接种于PDA平板上，25°C下生长3天，挑新鲜菌丝，接种于 装有体积PDB的250mLS角瓶中。25°C12化/min,培养3-4天，至生成大量菌丝团为止。双 层纱布过滤，蒸馈水连续冲洗，滤纸吸干水分，置于1.5mL离屯、管-20°c保存备用。 表一供试菌株的来源及编号[002引二、真菌DNA的提取 采用改进的CTAB法提取真菌菌丝DNA，具体步骤如下： (1)取适量的菌丝（约0.5g)于研鉢中，加液氮快速磨成粉末（至少加液氮研磨3 次)； (2)将样品粉末用灭菌的药匙转移到1.5mL的离屯、管中，加700化在65°C水浴锅中 预热的CTAB提取缓冲液，然后将离屯、管放在65°C的恒溫水浴中保持45min，每隔lOmin轻轻 的颠倒几次，使粉末和缓冲液混合均匀； (3)12000巧m，4°C 离屯、lOmin，吸取上清液； (4)加入70化L抽提液I (苯酪:氯仿：异戊醇=25 :24:1 )，轻轻颠倒数次至溶液混 匀； (5)12000巧m，4°C 离屯、lOmin，吸取上清液； (6)加入70化L抽本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种玉米小斑病病原物的快速检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：（1）真菌菌丝的收集；（2）真菌DNA的提取；（3）PCR扩增：PCR反应体系为，正向引物X‑EF和反向引物X‑ER各1μL，DNA模板1μL，Taq PCR Master Mix 12.5μL，ddH2O补至25μL；PCR反应程序为94℃预变性3min；94℃变性30s、52.9℃退火30s、72℃延伸30s，共32个循环；72℃延伸10min，4℃保存。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张猛，马庆周，耿月华，武海燕，于思勤，
申请(专利权)人：河南农业大学，
类型：发明
国别省市：河南;41