一种兔多杀性巴氏杆菌的DNA疫苗及制备方法技术

本发明专利技术属于分子生物学及免疫学领域，公开了一种兔多杀性巴氏杆菌的DNA疫苗及制备方法。本发明专利技术所述兔多杀性巴氏杆菌的DNA疫苗包含表达兔多杀性巴氏杆菌Omp H1基因的重组质粒。本发明专利技术所述DNA疫苗采用肌肉注射进行接种，无需皮下注射，免疫接种操作方便。同时本发明专利技术所述DNA疫苗不会引起毒力增强或导致基因整合，也不会引起兔歪头、抽搐或急性死亡等，安全无副作用。实验表明所述兔多杀性巴氏杆菌的DNA疫苗能诱导兔产生良好的体液免疫和细胞免疫，适用于兔多杀性巴氏杆菌的免疫接种，防治兔多杀性巴氏杆菌病的发生与流行。本发明专利技术所述兔多杀性巴氏杆菌的DNA疫苗制备方法简单，制备成本低，适合于工业化生产。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学及免疫学领域，具体涉及一种兔多杀性巴氏杆菌的DNA疫苗及制备方法，尤其是涉及一种基于兔多杀性巴氏杆菌OmpH1基因的DNA疫苗。
技术介绍
兔巴氏杆菌病是由多杀性巴氏杆菌引起的一种人兽共患的多型性传染病。当饲养管理不善、营养缺乏、饲料突变、过度疲劳、长途运输、寄生虫感染以及寒冷、闷热、潮湿、拥挤、圈舍通风不良、阴雨绵绵等，使兔子抵抗力降低时，病菌易乘机侵入体内，发生内源性感染。病兔的粪便、分泌物可以不断排出有毒力的病菌，污染饲料、饮水、用具和外界环境，经消化道而传染给健康兔，或由咳嗽、喷嚏排出病菌，通过飞沫经呼吸道而传染，吸血昆虫的媒介和皮肤、粘膜的伤口也可发生传染。根据感染的部位不同，分为：鼻炎型、流行性肺炎、败血症、子宫积脓、睾丸炎、中耳炎和结膜炎等。是引起9周龄～6月龄兔死亡的一种最主要的传染病。兔巴氏杆菌病急性爆发会造成兔群的大批死亡，而慢性感染会由于无法根治造成病情反复，或出现混合感染而无法根治，给养兔业带来巨大的经济损失，被列为重点防治的兔传染病。目前兔巴氏杆菌病多采用兔巴氏杆菌灭活苗或多联苗防治。然而兔巴氏杆菌灭活苗或多联苗免疫效果稳定性差，且要求皮下注射，操作复杂。高等动物疫病防控研究表明，DNA疫苗能引起强性细胞免疫，因而是预防疾病的有效手段之一。另外，DNA疫苗具有高稳定性、无毒性等特点，是一种理想的疫苗形式。因此，开发兔巴氏杆菌病的DNA疫苗对兔巴氏杆菌病的防治具有重要意义。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于：提供一种兔多杀性巴氏杆菌的DNA疫苗及制备方法。本专利技术所述DNA疫苗能诱导兔产生良好的体液免疫和细胞免疫，无需皮下注射，操作简便，且不引起兔产生不良反应，具有良好的生物安全性。为实现本专利技术的目的，本专利技术采用如下技术方案。一种兔多杀性巴氏杆菌的DNA疫苗，包含表达兔多杀性巴氏杆菌OmpH1基因的重组质粒。其中，所述兔多杀性巴氏杆菌OmpH1基因具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述重组质粒为pET30-OmpH1。本专利技术还提供了所述兔多杀性巴氏杆菌的DNA疫苗的制备方法，获取兔巴氏杆菌OmpH1基因，构建重组质粒。在一些实施方案中，所述获取兔巴氏杆菌OmpH1基因的方法为用含有限制性内切酶酶切位点的兔巴氏杆菌OmpH1基因特异性引物，以兔多杀性巴氏杆菌总DNA为模板，扩增出兔巴氏杆菌OmpH1基因，回收纯化目的基因片段。优选的，所述含有限制性内切酶酶切位点的兔巴氏杆菌OmpH1基因特异性引物中上游引物具有SEQIDNO:2所示的核苷酸序列，即为5′TGGATCCATGAAAAAGACAATCGTAC3′；所述下游引物具有SEQIDNO:3所示的核苷酸序列，即为5′ATCTCGAGTGTACGCGTAAACCT3′。本专利技术所述兔多杀性巴氏杆菌的DNA疫苗的制备方法中所述构建重组质粒的方法优选为纯化回收后的兔巴氏杆菌OmpH1基因，与用限制性内切酶酶切的表达载体相连，转入宿主细胞中培养后提取质粒。在一些实施方案中，所述表达载体为pET30。在一些实施方案中，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21。优选的，本专利技术所述兔多杀性巴氏杆菌的DNA疫苗的制备方法中所述限制性内切酶为BamHⅠ和XhoⅠ。本专利技术所述兔多杀性巴氏杆菌的DNA疫苗能诱导兔产生良好的体液免疫和细胞免疫。因此，本专利技术还提供了所述兔多杀性巴氏杆菌的DNA疫苗在预防和治疗兔多杀性巴氏杆菌病中的应用。由上述技术方案可知，本专利技术提供了一种兔多杀性巴氏杆菌的DNA疫苗及制备方法。本专利技术所述兔多杀性巴氏杆菌的DNA疫苗包含表达兔多杀性巴氏杆菌OmpH1基因的重组质粒。本专利技术所述DNA疫苗采用肌肉注射进行接种，无需皮下注射，免疫接种操作方便。同时本专利技术所述DNA疫苗不会引起毒力增强或导致基因整合，也不会引起兔歪头、抽搐或急性死亡等，安全无副作用。实验表明所述兔多杀性巴氏杆菌的DNA疫苗能诱导兔产生良好的体液免疫和细胞免疫，适用于兔多杀性巴氏杆菌的免疫接种，防治兔多杀性巴氏杆菌病的发生与流行，具有良好的经济效益和生态效益。本专利技术所述兔多杀性巴氏杆菌的DNA疫苗制备方法简单，制备成本低，适合于工业化生产。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1示实施例1中本专利技术的兔多杀性巴氏杆菌OmpH1基因DNA疫苗的制备流程图；图2示实施例1中目的基因的克隆的PCR鉴定结果图；其中泳道M为Maker2000，泳道1为OmpH1目的基因片段；图3示实施例1中为重组质粒构建的鉴定结果图；其中泳道M为DNA分子质量标准，泳道1为λ-HindⅢdigestDNAMarker，泳道2为pET30-OmpH1重组表达质粒，泳道3为pET30-OmpH1经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后产物。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例1、兔多杀性巴氏杆菌OmpH1基因的DNA疫苗的制备1、表达引物的设计根据兔巴氏杆菌基因组序列，设计用于扩增兔多杀性巴氏杆菌(C51-2-499)OmpH1基因的两条引物P1和P2，并分别在两5′端引入BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点。引物序列：P1：5′TGGATCCATGAAAAAGACAATCGTAC3′(SEQIDNO:2)；P2：5′ATCTCGAGTGTACGCGTAAACCT3′(SEQIDNO:3)。2、目的基因的克隆①兔多杀性巴氏杆菌总DNA的提取取2mL菌液于微量离心管中，6000r/min离心5min收集沉淀。将沉淀用500μLNET缓冲液溶解并于80℃水浴15min；从水浴锅中取出微量离心管室温放置2min而后加入12μL溶菌酶，37℃消化4h；再次取出离心管室温放置2min，加入蛋白酶K、RNA酶50℃过夜消化；用等体积的酚-氯仿-异戊醇(体积比为25∶24∶1)混合物抽提2次，再用无水乙醇洗涤2次，放入温箱中使离心管内壁干燥；加入50μL无核酸酶的TE缓冲液溶解，置于-20℃冰箱中备用。②目的片段的扩增、克隆、重组质粒本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种兔多杀性巴氏杆菌的DNA疫苗，其特征在于，包含表达兔多杀性巴氏杆菌Omp H1基因的重组质粒。

【技术特征摘要】
1.一种兔多杀性巴氏杆菌的DNA疫苗，其特征在于，包含表达兔多杀
性巴氏杆菌OmpH1基因的重组质粒。
2.根据权利要求1所述的DNA疫苗，其特征在于，所述兔多杀性巴氏
杆菌OmpH1基因具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的DNA疫苗，其特征在于，所述重组质粒为
pET30-OmpH1。
4.权利要求1-3任意一项所述的DNA疫苗的制备方法，其特征在于，
获取兔巴氏杆菌OmpH1基因，构建重组质粒。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述获取兔巴氏杆菌
OmpH1基因的方法为用含有限制性内切酶酶切位点的兔巴氏杆菌OmpH1基
因特异性引物，从克隆质粒pMD-OmpH1中扩增出兔巴氏杆菌OmpH1基因，
回收纯化目的基因片段。
6.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：王开，
申请(专利权)人：上海珍岛信息技术有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31