本发明专利技术公开了一种Egfl8基因过表达慢病毒，包括含目的基因的GV208‑Egfl8慢病毒载体、以及慢病毒包装辅助载体pHelper 1.0质粒和pHelper 2.0质粒；所述GV208‑Egfl8慢病毒载体包括GV208慢病毒表达载体、以Egfl8 cDNA克隆为模板的Egfl8 cDNA PCR产物。此外，还公开了上述Egfl8基因过表达慢病毒的构建方法。本发明专利技术首次构建了Egfl8过表达慢病毒，能够高效便捷地感染肝癌细胞并明显上调后者中Egfl8基因的表达，能够有效降低肝癌细胞的侵袭运动能力，从而为肝癌的治疗提供了非常有效的抑制基因，对于肝癌的Egfl8基因治疗药物的制备具有重大意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术设及基因工程
，尤其设及一种Egfl8基因过表达慢病毒及其构建 方法和在制备治疗肝癌药物中的应用。
技术介绍
E奸 18(邱idermal growth factor-Uke domain 8,表皮生长因子样结构域8)是 由Fitdi等于2004年首先在小鼠中发现，其位于小鼠的17号染色体上，编码一个由293个氨 基酸组成的蛋白。人Egfl8基因则位于第6号染色体上(6P21.32)，与MHC区域相邻，编码一个 分子量为32KD的分泌型蛋白。蛇fl8蛋白包含有一个EGF样结构域、一个巧离子结合型EGF样 结构域和N末端的信号肤。 近年来，已研究证实Egfl8在结直肠癌组织中的表达明显下调，且其低表达与结直 肠癌的远处转移、?M分期及不良预后密切相关。此外，Egfl8在胃癌组织中亦呈低表达，且 其表达水平的下调与胃癌的腹膜播散及?M分期密切相关。运些结果提示Egfl8在人类恶性 肿瘤的侵袭转移中发挥了重要作用。而国际上最新的研究显示，下调小鼠胸腺上皮细胞中 E奸18的表达可使细胞粘附分子I CAM-1的表达明显上调，上调蛇f 18的表达则可使I CAM-1的 表达明显下调，即E奸18对胸腺上皮细胞中ICAM-1的表达具有反向调控的作用。此外，体内 注射重组的蛇fl8蛋白可抑制小鼠胸腺组织中Notch信号传导通路的表达。 综上所述，目前国内外对于Egfl8的研究，大多是集中于Egfl8在肿瘤组织中的表 达情况及其与肿瘤恶性程度及临床表现的相关性等方面，而对于Egf 18在人类恶性肿瘤尤 其是肝癌组织中的作用及机制等方面研究较少。Egfl8在细胞系中的研究也仅见于胸腺上 皮细胞，并且目前又缺少高效稳定上调肿瘤细胞中Egf 18表达的手段和方式。因此，构建 Egfl8过表达慢病毒载体及相应慢病毒，观察其感染肿瘤细胞后所产生的作用，对于研究 Egfl8在肿瘤发生、发展中的作用及机制都十分重要。目前，尚未见到关于构建蛇fl8过表达 慢病毒的研究和报道，也尚无任何研究报道蛇fl8在肝癌侵袭转移中的作用及机制。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种Egfl8基因过表达慢病毒及其 构建方法和应用，W高效便捷地实现Egf 18基因在肝癌细胞中的稳定过表达，通过感染 HCCLM3肝癌细胞系，从而抑制该肝癌细胞系的迁移运动能力。 本专利技术的目的通过W下技术方案予W实现： 本专利技术提供的一种Egf 18基因过表达慢病毒，包括含目的基因的GV208-蛇f 18慢病 毒载体、W及慢病毒包装辅助载体抑elper 1.0质粒和pHelper 2.0质粒;所述GV208-Egfl8 慢病毒载体包括GV208慢病毒表达载体、WEgfl8cDNA克隆为模板的Egfl8cDNAPCR产物； 其中PCR扩增引物为：[000引 E奸18上游引物： GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGGGGTCCAGGGCTGAGCTGTGCACTC(序列 1) E奸18下游引物： TCACCATGGTGGCGACCGGTCGATGATTGACGCCGAGGC(序列2)。 本专利技术提供的上述蛇fl8基因过表达慢病毒的构建方法，包括W下步骤：[001引（1化奸18过表达慢病毒载体的构建 (l-l)WEgfl8 cDNA克隆为模板，采用上述PCR扩增引物，通过PCR反应，扩增获得 E奸 18 cDNA PCR产物；[001引（1-2)GV208慢病毒表达载体进行Age I酶切，得到线性化的GV208慢病毒表达载 体； (1-3)将蛇fl8 cDNA PCR产物交换入线性化的GV208慢病毒表达载体，将得到的连 接液转化新鲜的感受态大肠杆菌细胞;并进行PCR鉴定； (1-4)PCR鉴定采用的引物为：[001 引 上游:CGGTGAATGCTGGTGGCATC(序列3); 下游：TCACCATGGTGGCGACCGGGCTCACACTCAACTGGGC(序列4); 对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对，比对正确的克隆即为构建成功的含目的 基因的GV208-E奸18慢病毒载体； (2化奸18过表达慢病毒的构建 将所述GV208-Egfl8慢病毒载体、W及慢病毒包装辅助载体pHelper 1.0质粒和 P化Iper 2.0质粒，同时共转染人胚肾细胞293T细胞，在该细胞中进行病毒的包装并分泌到 细胞外的培养基中，收集培养基离屯、后取得的上清液，经离屯、浓缩即为包含GV208-E奸18质 粒的蛇f 18过表达慢病毒。 本专利技术还提供了上述Egfl8过表达慢病毒在制备治疗肝癌药物中的应用，W及包 括上述蛇fl8过表达慢病毒的药物组合物。 本专利技术具有W下有益效果： 本专利技术首次构建了 Egfl8过表达慢病毒，能够高效便捷地感染肝癌细胞并明显上 调后者中Egfl8基因的表达，能够有效降低肝癌细胞的侵袭运动能力，从而为肝癌的治疗提 供了Egfl8基因运样一个非常有效的抑制基因，为开发相应的基因治疗措施提供了一种行 之有效的方法，对于肝癌的蛇fl8基因治疗药物的制备具有重大意义。【附图说明】 下面将结合实施例和附图对本专利技术作进一步的详细描述： 图1是GV208质粒DNA图谱； 图 2 是pHelper 1.0质粒 DNA图谱；图3是pHelper 2.0质粒DNA图谱； 图4是Egfl8过表达慢病毒及阴性对照慢病毒感染HCCLM3肝癌细胞后的结果示意 图（NC:阴性对照组;0E:E奸18过表达组）； 图5是蛇fl8过表达慢病毒及阴性对照慢病毒感染HCCLM3肝癌细胞后Egfl8蛋白表 达水平示意图（A:Weste;rn blot检测Egfl8表达的结果；B:Weste;rn blot结果统计直方图； NC:阴性对照组;0E: E奸18过表达组;CON:空白组）； 图6是Egfl8过表达慢病毒及阴性对照慢病毒感染HCCLM3肝癌细胞后侵袭实验的 结果示意图（A:Transwell小室聚碳脂膜拍照照片;B:侵袭实验结果统计直方图;NC:阴性对 照组;0E: E奸18过表达组;CON:空白组）； 图7是Egf 18过表达慢病毒及阴性对照慢病毒感染HCCLM3肝癌细胞后划痕实验的 结果统计直方图（NC:阴性对照组;0E:蛇f 18过表达组;CON:空白组）。【具体实施方式】 图1~图7所示为本专利技术的实施例， 通过设计和构建人Egfl8基因过表达慢病毒，W高效感染肝癌细胞并明显上调后者中蛇fl8 基因的表达，从而有效降低肝癌细胞的侵袭运动能力。 1、构建蛇f 18过表达慢病毒载体 WEgf 18 cDNA克隆(BC052591)为模板，设计PCR扩增引物如表1所述（同序列表中 序列1和序列2)，通过PCR反应（反应体系及条件分别见表2和表3)，扩增获得大小925bp的 PCR产物。GV208慢病毒表达载体DNA图谱见图1，对其进行Age I酶切，酶切体系见表4，酶切 条件为37°C解育化。将Egfl8 cDNA PCR产物交换入线性化慢病毒表达载体，连接反应体系 见表5,反应条件为25°C解育30分钟，再42°C解育15min。将连接液转化新鲜的感受态大肠杆 菌细胞(转化操作参考:分子克隆实验指南第二版55-56页）。 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种Egfl8基因过表达慢病毒，其特征在于：包括含目的基因的GV208‑Egfl8慢病毒载体、以及慢病毒包装辅助载体pHelper 1.0质粒和pHelper 2.0质粒；所述GV208‑Egfl8慢病毒载体包括GV208慢病毒表达载体、以Egfl8 cDNA克隆为模板的Egfl8 cDNA PCR产物；其中PCR扩增引物为：Egfl8上游引物：GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGGGGTCCAGGGCTGAGCTGTGCACTC(序列1)Egfl8下游引物：TCACCATGGTGGCGACCGGTCGATGATTGACGCCGAGGC(序列2)。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：吴帆，王百林，陈为佳，
申请(专利权)人：吴帆，
类型：发明
国别省市：广东;44
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。