本发明专利技术公开了水稻几丁质激发子结合蛋白（Chitin elicitor binding protein）基因启动子（OsCEBiPP），属于植物基因工程技术领域。本发明专利技术启动子来源于SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，控制水稻几丁质激发子结合蛋白基因仅在水稻维管束或维管束韧皮部细胞中特异表达。比较分析发现，CGTCA-motif功能元件可能调控了基因在韧皮部细胞中的特异表达，5UTR Py-rich stretch和GT1GMSCAM4功能元件影响了全长启动子的转录活性。本发明专利技术启动子可以用于外源基因在水稻维管束或维管束韧皮部中特异表达。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物技术和植物学领域;具体设及一种水稻几下质激发子结合基因启 动子的分离鉴定和应用。
技术介绍
水稻是目前农业生产和科学研究的热点植物，在完成水稻全基因组计划之后，其 功能基因组的研究得到越来越多的广泛关注，特别是对一些调控水稻重要农业性状基因的 研究日益受到研究人员的重视。 几下质激发子蛋白（OsC邸iP)是定位于水稻细胞膜表面的受体，具有胞外LysM受 体结构域，该蛋白识别真菌几下质信号从而激发水稻的免疫反应。Kaku等人第一个克隆了 OsCEBiP基因，证明它在植物的抗病反应中发挥重要作用化aku等，2006Plant cells recognize chitin fragments for defense signaling through a plasma membrane receptor.Proceedings of the National Academy of Sciences 103:11086-11091)。而 该基因启动子的功能尚未研究，尤其是其作用方式尚不清楚。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种具有维管束组织表达特异性的水稻几下质激发子结 合蛋白基因启动子及其应用。[000引在本专利技术的第一方面，提供一种分离的多核巧酸，所述的多核巧酸，位于水稻几下 质激发子结合蛋白基因 OsCEBiP的起始密码子ATG上游1807bp的范围，序列如SEQ ID N0:1; 根据植物顺式调控元件数据库(肥WPLACE和化ACE)的捜索，本专利技术所提供的启动子区域含 有多个组织特异性的顺式作用元件(如图1、图2所示）。启动子含有1个脱落酸和巧离子响应 的顺式作用元件ABRERATCAL，3个抗病反应应答元件BIHD10S，2个莱莉酸应答元件〔6^八- mo t i f，1个抗病反应应答元件GT1GMSCAM4，1个抗旱应答元件MBS，1个伤信号应答元件WUN- motif，10个抗病应答元件W服Y710S，1个转录活性调控元件抓TR P厂rich stretch等8个主 要的顺式作用元件。 在本专利技术实施例中，利用所述启动子OsCEBiPP构建得到6个包括全长及截短启动 子片段的植物表达载体pCAMBIA1391Z-〇sCEBiPP(如图3所示），分别命名为C0.2，C0.4， CO. 6，CO . 9，Cl. 3和Cl. 8，通过农杆菌介导的遗传转化方法将所述载体转化水稻品种，各长 度启动子在愈伤时期和幼叶时期观察到报告基因 β-葡萄糖巧酶GUS的表达(如图4所示）； C0.2，C0.4可W在植物的维管束中观察到报告基因 GUS的表达，C0.6，C0.9，C1.3可W在植物 的维管束初皮部中观察到报告基因 GUS的表达(如图5所示），C0.2，C0.4，C0.6，C0.9，C1.3和 C1.8的表达强度依次降低(如图6所示）。 因此，本专利技术提供W下多核巧酸：[000引（l)SEQ ID NO: 1中第1-164位所示的核巧酸序列的多核巧酸； (2)SEQ ID NO: 1中第1-372位所示的核巧酸序列的多核巧酸； (3)SEQ ID NO: 1中第1-556位所示的核巧酸序列的多核巧酸； (4)SEQ ID NO: 1中第1-883位所示的核巧酸序列的多核巧酸；[001引（5)沈Q ID NO: 1中第1-1282位所示的核巧酸序列的多核巧酸； 本领域技术人员应当理解根据（1)、（2)、（3)、（4)、（5)所示的核巧酸序列，对其替 换、缺失和/或增加一个或几个核巧酸，也可W获得具有维管束组织表达特异性的核巧酸序 列，例如，在非应答原件或作用原件，替换一个或几个碱基。另外，本领域技术人员还可W根 据SEQ ID NO. 1的序列获得其它具有控制基因时空特异表达的DNA功能片段，运种功能片段 是能受褐飞風取食诱导，增强基因表达，并且具有维管束组织表达特异性的核巧酸序列。 本专利技术的另一方面，提供(1)、（2)、（3)、（4)、巧)所述的多核巧酸的用途，用于指导 目的基因在植物维管束中特异表达。 本专利技术的另一方面，提供(3)、（4)、（5)所述的多核巧酸的用途，用于指导目的基因 在植物维管束初皮部中特异表达。 在本专利技术的另一方面，提供一种载体，所述的载体含有所述的（1)、（2)、（3)、（4)、 (5)多核巧酸的任一个，作为启动子元件。 在本专利技术的一个优选例中，将目的基因可操作地连接到本专利技术的启动子之下，构 建得到表达盒，进一步可将该表达盒导入植物表达载体，获得组织特异表达的重组表达载 体。因此，本专利技术还包括由上述启动子构建的表达盒，W及含有上述启动子或表达盒的表达 载体或重组表达载体。 本专利技术启动子可W用于制备转基因植物。比如，通过农杆菌介导、基因枪法W及花 粉管通道等方式获得转基因植物。从而可W通过引入重要的农艺性状基因，培育出高效特 异表达的植株，从而达到改良品种的目的，例如引入抗性基因在维管束中表达，用来提高植 物抗刺吸式昆虫的能力。 通过定量PCR和半定量PCR，检测水稻根、茎和叶片组织几下质激发子结合蛋白基 因 OsCEBiP在根、茎、叶中都有表达，其中在幼叶中表达量最高。 通过定量PCR技术，检测水稻几下质激发子结合蛋白基因 OsCEBiP受褐飞風取食时 间的相对表达量，可W看到随着褐飞風取食时间的增加，OsCEBiP的表达量逐渐升高（如图8 所示）。 本专利技术的优点和效果： 1、本专利技术的启动子为组织特异表达，可W用于基因在植株维管束和维管束初皮部 细胞中的特异表达的研究。 2、本专利技术的启动子与植物的抗病抗虫相关，可W用于提高植物抗病抗虫反应的研 究。【附图说明】 图1 .启动子序列，下划线表示5'UTR区，方框表示启动子基本元件TATA-box或 CAAT-t)〇x。 图2.根据顺式作用元件在启动子序列上的分步构建了 6个全长及截短启动子载体 的示意图，该启动子含有8个功能元件。 图3.各长度表达载体pCAMBIA1391Z-〇sCEBiPP的物理图谱，该载体含有潮霉素抗 性筛选基因，启动子被融合到GUS基因5'端转录非翻译区。图4.GUS活性检测，图A:愈伤时期，B:种子时期，C: 6天的苗期，D: 20天的苗期等生 长。如图显示，在愈伤组织，6天苗期的幼根幼芽，20天苗期的幼叶中有蓝色。5染色后的石蜡切片。如图显示，0).2、0).4可^在植物的维 管束中观察到报告基因 GUS的表达，0).6、0).9、(：1.3可^在植物的维管束初皮部中观察到 报告基因 GUS的表达，C1.的受有观察到报告基因 GUS的表达。GUS染色的位置用箭头表示。 图6.蛋白杂交分析0).2、0).4、0).6、0).9、(：1.3和(：1.8叶片报告基因61]5表达量。 如图显示，0).2、0).4、0).6、0).9、(：1.3、(：1.8表达强度依次降低。 图7.定量PCR和半定量PCR检测OsCEBiP基因在水稻各组织器官中的表达。actin为 对照基因，YR:生长18天的幼根，YS:生长18天的幼茎，YL:生长18天的幼叶，MR:生长67天的 成熟根，MS:生长67天的成熟茎，ML:生长67天的成熟叶。数据显示OsCEBiP基因在幼叶中表 达最局。 图8本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸是：(1)SEQ ID NO：1中第1‑164位所示的核苷酸序列的多核苷酸；(2)SEQ ID NO：1中第1‑372位所示的核苷酸序列的多核苷酸；(3)SEQ ID NO：1中第1‑556位所示的核苷酸序列的多核苷酸；(4)SEQ ID NO：1中第1‑883位所示的核苷酸序列的多核苷酸；(5)SEQ ID NO：1中第1‑1282位所示的核苷酸序列的多核苷酸；中的任意一个，所述的SEQ ID NO：1是水稻几丁质激发子结合蛋白基因的启动子OsCEBiPP的核苷酸序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：何光存，杜霸，杜波，陈荣智，祝莉莉，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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