本公开主要涉及用于通过动力学受控过程使用工程化的重编程因子来产生诱导多能干细胞(iPSC)的新方法和组合物。具体地，本公开涉及建立重编程因子的组合，包括在常规重编程因子间与反式激活结构域之间的融合，其经优化用于重编程各种细胞。更具体地，本文所公开的示例性方法可用于从各种哺乳动物细胞类型，包括人成纤维细胞产生诱导多能干细胞。还公开了使用合成信使RNA，无饲养层衍生人诱导多能干细胞的示例性方法。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】使用合成信使RNA无饲养层衍生人诱导多能干细胞 相关申请本申请要求2013年5月13日提交的美国申请序列号13/893，166的权利并是它的部分连续案；该申请要求2012年5月13日提交的美国临时申请序列号61/646,292的优先权的权利。这些申请的每一个的内容在此以其整体引为参考。
本公开主要涉及用于通过受控方法使用一种或多种工程化的重编程因子来生成诱导多能干细胞(iPSC)的新方法和组合物。具体地，本公开涉及建立重编程因子的组合，所述组合包括常规重编程因子与反式激活结构域间的融合，其经优化用于多种细胞类型的重编程。更具体地，本文所公开的示例性方法可用于从多种哺乳动物细胞类型，包括非人的灵长类动物细胞产生诱导多能干细胞。还公开了使用合成的信使RNA，无饲养层衍生人诱导多能干细胞的示例性方法。
技术介绍
以下包括了可能有助于理解本公开各个方面和实施方式的信息。这并非承认任何此处所提供的信息是现有技术，或与本文描述或要求保护的专利技术相关，或者任何明确或隐含引用的出版物或文件是现有技术。诱导多能干细胞(iPSC)的治疗潜能激发了开发重编程方法的努力，来回避对体细胞进行基因修饰以实现重编程进入多能状态的需求。第一批在这方面成功实现的“非整合”方式一一蛋白转导，质粒转染和利用腺病毒载体一一由于得到的iPSC的转化率低而在应用中受到限制。最近已证明，采用游离型DNA、仙台病毒、和合成的信使RNA(mRNA)的技术产生的“无足迹” iPSC，得到的效率相当于或超过使用整合病毒载体得到的效率。RNA转染原则上是这些方法中最有吸引力的，因为它提供对重编程因子(RF)表达时间过程的精确控制，而完全避免了对于“清理”被重编程的细胞以清除载体的残余痕迹的任何要求。然而，由于为诱导人细胞中的多能性而要求每日重新转染持续约2周的这一需求，目前基于mRNA的重编程流程相对劳动强度较大。这些过程还依赖于使用饲养层细胞，这增加了过程的复杂性和技术上的可变性，同时引入了非人源的(“异种”)的生物材料的潜在污染源。生成诱导多能干细胞(iPSC)的主要困难是将分化细胞重编程为多能细胞的效率低。先前已经报道，当用由0ct4和MyoD的反式激活结构域(称为M30)组成的融合基因，连同Sox2，Klf4和c-Myc(SKM)转导的时候，5%的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)被重编程成iPSC。此夕卜，在大多数转导的MEF中，包括没有成为iPSC的细胞中，M30促进多能性基因的染色质重塑。这些观察表明了在给予更有利的培养条件下超过5%的细胞获得成为iPSC的能力的可能性。
技术实现思路
由于RNA分子一旦被转染到细胞，特别是哺乳动物细胞时由其引起的潜在的细胞免疫应答，用mRNA成功重编程非人源细胞一直难以实现。在重编程人成纤维细胞的过程中，通常的做法是使用一种病毒蛋白作为诱饵受体使转染的mRNA分子诱导的干扰素减效。然而，使用诱饵受体的这种策略或其它类似策略都没有成功地将源自非人类物种，包括狒狒、马和狗的成纤维细胞重编程。因此，为了解决这些缺陷，本公开提供了用于生成能够产生身体的所有的不同组织的干细胞的方法和组合物。在某些方面，使用信使RNA分子且不需要病毒载体或饲养层细胞，本文公开的方法可用于将非人源成纤维细胞重编程为诱导多能干细胞(iPSC)。与之前报道的细胞重编程方法学相比，使用的示例性方法和组合物产生了令人惊讶的和意想不到的改进效率，并且克服了先前未解决的在非人类哺乳动物细胞中抑制细胞免疫反应的问题。因此，提供了方法、试剂和/或组合物，其可用于通过改进重编程因子(RF)混合物，特别是通过应用常规重编程因子，如0ct4(也被称为0ct3/4)，SoX2等的工程化变体，并结合已知的强转录因子如VP16和MyoD的反式激活结构域而加速mRNA介导的重编程。本文所公开的方法和组合物得到了一个无饲养层的方案，其极大地减少了涉及基于mRNA的重编程的时间，成本和精力。一方面，本公开提供了一种用于对体细胞进行去分化或重编程的方法，其包含:a)用组合物转染分离的体细胞，所述组合物包含有效量的融合产物，该融合产物为选自0ct4、3(?2、1(1￡4、015^、他1108和1^1128的任意一种或多种合成1]11?嫩重编程因子与反式激活结构域之间形成的融合产物，从而所述体细胞被重编程或去分化。在一个实施方式中，提供了权利要求1的方法，其中组合物包含融合于N末端的MyoD反式激活结构域的0ct4。在一个实施方式中，0ct4融合到三倍串联形式的N-末端的MyoD反式激活结构域。在一个方面，提供了用于通过使用权利要求1的重编程因子的合成mRNA中的任意一种或多种对哺乳动物细胞进行重编程的方法，所述方法包含:a)将靶细胞以1.5万到50万个细胞每标准6孔板的孔的密度生长在无饲养层表面上;b)重编程期间用每次50ng/ml到800ng/ml mRNA的不同剂量转染细胞。在一个实施方式中，靶细胞以3万、7.5万、10万、或15万细胞/标准6孔板的孔的密度生长在无饲养层表面上;b)重编程期间用每次50ng/ml到800ng/ml mRNA的不同剂量转染细胞，而更早的时间点比稍后的时间点使用较低剂量;c)无需传代而获得iPSC。在一个实施方式中，靶细胞以1.5万、7.5万、10万、或15万细胞/标准6孔板的孔的密度生长在无饲养层表面上，而每孔的体积调整为0.5ml至5ml之间的适当培养基；重编程期间用每次50ng/ml到800ng/ml mRNA的不同剂量转染细胞，而更早的时间点比稍后的时间点使用较低剂量;无需传代而获得iPSC。在特定实施方式中，在整个重编程过程中使用较低剂量减少了细胞免疫应答并产生了提高的iPSC成功率。在其他实施方式中，使用高纯度的mRNA分子，即没有来自体外转录的污染性异常转录本，使细胞得以以较低的密度植入，在重复转染下存活，并获得更高的iPSC的产量。在一个实施方式中，所述哺乳动物细胞是人细胞。在一个实施方式中，所述方法无异种。在一个实施方式中，所述哺乳动物细胞是非人灵长类动物细胞。在一个实施方式中，所述非人灵长类动物细胞是食蟹猴细胞。在一个实施方式中，所述一种或多种因子选自mRNA、调控RNA、siRNA、miRNA以及它们的组合。在一个实施方式中，所述体细胞用至少两种不同的RNA转染。在一个实施方式中，所述体细胞选自单能、专能(multipotent)、多能(pluripotent)、以及分化的细胞。在一个实施方式中，所述一种或多种RNA诱导体细胞去分化成单能细胞、专能细胞、或多能细胞。在一个实施方式中，所述至少一种因子选自0CT4，S0X2，NANOG，LIN28，KLF^PMYCmRNA。在一个实施方式中，0CT4，S0X2，NANOG，和LIN28的mRNA组合施用。在一个实施方式中，0CT4，S0X2，KLF4 和 MYC 的 mRNA 组合施用。在一个实施方式中，将转染的细胞保持在培养物中作为诱导多能干(iPS)细胞。在一个实施方式中，所述转染的细胞形成诱导多能干细胞，其进一步包含诱导iPS细胞形成分化细胞。在一个方面，提供了一种用于治疗或抑制患者中的疾病或病症的一种或多种症状的方法，其包括在体外去分化细胞和本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种对体细胞进行去分化或重编程的方法，其包括：用组合物转染分离的体细胞，所述组合物包含：有效量的在选自Oct4、Sox2、Klf4、cMyc、Nanog和Lin28的任意一种或多种合成mRNA重编程因子与反式激活结构域之间形成的融合产物，由此体细胞被重编程或去分化。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
【专利技术属性】
技术研发人员：王继武，
申请(专利权)人：美国绿阳生物技术及医药公司，
类型：发明
国别省市：美国;US
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