本发明专利技术涉及水疱性口炎病毒（VSV）基质（M）蛋白突变体。一种突变体M蛋白包括在位点（21）甘氨酸变成谷氨酸，在位点（111）亮氨酸变成丙氨酸以及在位点（51）蛋氨酸变成精氨酸。另一种M蛋白突变体包括在位点（22）甘氨酸变成谷氨酸以及在位点（48）和（51）蛋氨酸变成精氨酸。这些具有所述突变体M的新的rVSV显著地减毒并失去了毒性，所述毒性包括神经毒性，并且能够诱导对相关抗原的免疫应答。此外，具有第一次描述的M突变体的rVSV印第安纳血清型在31℃能够有效复制，且在约37℃以上较差复制或者不能复制。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术总体上设及生物技术和免疫学。具体地，本专利技术设及水瘤性口炎病毒(VSV) 的改性基质(^0蛋白、表达该改性M蛋白的减毒的重组体vsv和vsv基初免-加强免疫苗，该初 免-加强免疫苗诱导持久的体液、细胞介导和粘膜免疫应答，对抗携带外源基因的重组体 VSV所表达的外源抗原。
技术介绍
。实质上，VSV感染猪、牛和马，并且在口和足周围引发水瘤性疾 病。虽然已经报导了由VSV引起的人感染，但是VSV在人体内没有引起任何严重的症状 。 VSV编码五种蛋白，核衣壳(nucleocapsid)蛋白（N)、憐蛋白（P)、基质蛋白（M)、表 面糖蛋白（G)和RNA依赖性RNA聚合酶化）dVSV的N、P和L蛋白是合成正义和负义基因组RNA和 mRNA所需要的，其对合成VSV蛋白是必要的。 通过VSV基质(M)蛋白阻断宿主细胞蛋白质合成诱导了细胞死亡。将水瘤性口炎病 毒印第安纳血清型(VSVind)中Μ蛋白在位点51的蛋氨酸残基变成精氨酸(M51R)，并且将水瘤 性口炎病毒新泽西血清型(VSVnj)M基因中在位点48(Met48)和51(Met51)的蛋氨酸变成精氨 酸(A;rg)，能够使VSV Μ蛋白的运种功能无效化im, G. and Kang, C, Virology, 357:41- 53, 2007)。尽管在Μ蛋白质中有运些Met向Arg突变的VSV已经显著地减少了细胞病变效应， 但是他们依然在细胞和受感染的动物中复制并产生子代病毒。VSVind奥尔赛(Orsay)菌株的 一种溫度敏感的（ts)M基因突变体，ts023已经在小鼠胶质细胞系在37°C和39°C显示了有限 的复制（Rabinowitz, S. et al. Infection and Immunity 33:120-125, 1981)。已经证 实，ts023的溫度敏感性是在39°C具有特征性子弹状结构的病毒装配启动不当或缺乏的结 果（Flood, E. et al. Virology 278:520-533, 2000; Lyles, D. et al. Virology, 217:76-87，1996)。此外，即便在直接接种到大脑中后，ts023在小鼠内也失去它的神经毒 性(Rabinowitz, S, et al. Infection and Immunity, 33:120-125, 1981)。[000引在VSV奥尔赛菌株的野生型M和ts023的M之间有Ξ个氨基酸差异，运些差异是在第 21个氨基酸的甘氨酸(G)对谷氨酸(EKG2化），在第111个氨基酸的亮氨酸(L)对苯丙氨酸 (巧化111F)，W及在第227个氨基酸的组氨酸(H)对酪氨酸(Y)(H227Y)(Morita，K. et al. J. Virol. 61:256-263，1987)。回复突变体(revertant)中在Fill的单一氨基酸回复突变 成L表明Fill看来像是在ts023的溫度敏感性方面起到了主要作用。然而，其它两种突变可 能也有一些作用，因为在第111位点由F向L的单一突变没有完全地使病毒恢复到其野生型 显型（Morita, K. et al. J. Virol. 61:256-263，1987; Li, Y. et al. J. Virol. 62:3729-3737, 1988)0 考虑到回复突变体中在Fill的单一氨基酸回复突变成L，其可能有利于引起既对 回复突变较不敏感又在ts023的溫度敏感性方面起作用的突变。 目前，研究组已经开发出能复制的、装配缺陷的VSV作为更安全的疫苗载体，该VSV 缺失了G糖蛋白化)基因（Δ口或缺失了G和Μ基因两者（AMGXK址η, J. et al. J. Virol. 75:11079-11087，2001; Schwartz, J. et al.，Virology 366:166-73，2007)。然而，已 缺失了G基因，或缺失了Μ和G基因，VSV载体需要G或Μ和G两者反式蛋白（proteins in 化ans)的供应W生产装配缺陷的VSV。为了降低生产疫苗的成本，有必要生成运样的系统， 其能够生产能W高滴度(titer)复制的病毒疫苗载体。因此，所需要的是运样的VSV载体系 统，其可W是已经失去了它的毒性(无毒性的），并且在31°C仍然能够在体外复制到高滴度 的全长VSV载体，在非容许性溫度下不能适当地装配，诱导良好的对抗其表达的关注的基因 的免疫应答，并且具有较少机会回复到到野生型显型。 本专利技术的进一步的和其它的目的将由W下的
技术实现思路
、专利技术的讨论及其实施方案 和实施例实现。
技术实现思路
专利技术人已经生成了新的水瘤性口炎病毒(VSV)的基质(M)蛋白突变体，其包括VSV 印第安纳血清型(VSVind)和VSV新泽西血清型(VSVnj)。运些具有突变体Μ蛋白的新的VSV基本 上是非胞溶性的的、显著地减毒的和无毒性的的，包括神经毒性(更安全的）。此外，运些新 的具有突变体Μ蛋白的VSV能够诱导对抗关注的抗原或抗原决定部位（邱itope)的免疫应 答。该免疫应答可W是体液、细胞和粘膜免疫应答。此外，具有Μ突变体的VSVind在31°C能够 装配且通常地能够从受感染的细胞释放出来，但他们不能在37°C或更高溫度下适当地装 配，且相对于野生型VSVind，病毒从受感染的细胞的释放显著地减少了。此外，相对于现有技 术已知的Μ蛋白突变体，本专利技术的Μ蛋白突变体对回复突变可能较不敏感。 照此，在一个实施方案中，本申请设及一种水瘤性口炎病毒(VSV)的改性基质(Μ) 蛋白。在一个实施方案中，本专利技术的改性Μ蛋白包括选自（i )和（i i )的氨基酸序列：（i )包括 至少W下置换:G21E/L111A/M51R的SEQ ID NO: 3;及（ii)包括至少W下置换:G2沈/M48R/ M51R的沈QID NO: 8。在本专利技术的一方面，SEQ ID NO: 8包括至少W下置换:G22E/L110A/ M48R/M51R。 在本专利技术的一个实施方案中，（i)的改性Μ蛋白包括氨基酸序列SEQ ID NO: 4,且 的改性Μ蛋白包括氨基酸序列沈Q ID NO: 9或沈Q ID NO: 10。 在本专利技术的一个实施方案中，（i)中在位点21的E和（ii)中在位点22的E由gaa密码 子编码，且其中（i )和（i i )中在位点51的R及（i i )中在位点48的R由cga密码子编码。 在本专利技术的一个实施方案中，SEQ ID NO: 4的在位点111的A和SEQ ID NO: 10的 在位点110的A由gca密码子编码。 在本专利技术的一个实施方案中，（i)的氨基酸序列由包含SEQ ID NO: 2的基因编码， 且（ii)的氨基酸序列由包含沈Q ID NO: 6或沈Q ID NO: 7的基因编码。 在另一个实施方案中，本专利技术提供了一种编码水瘤性口炎病毒(VSV)的改性的基 质00蛋白的核巧酸序列或基因，其中该核巧酸序列或基因包括选自SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 6和沈Q ID NO: 7的核巧酸序列。 在另一个实施方案中，本专利技术提供了一种重组体VSV(rVSV)。本专利技术的rVSV，在一 个实施方案中，包括核巧酸本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种水疱性口炎病毒（VSV）的改性基质（M）蛋白，其中该改性M蛋白包含选自（i）和（ii）的氨基酸序列：（i）包括至少以下置换：G21E/L111A/M51R的SEQ ID NO: 3；及（ii）包括至少以下置换：G22E/L110A/M48R/M51R的SEQ ID NO: 8。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：池永·康，京永·金，
申请(专利权)人：西安大略大学，
类型：发明
国别省市：加拿大;CA
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