一种骨肉瘤诊疗制剂及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种骨肉瘤诊疗制剂及其应用，更具体的涉及mir-6779和/或其成熟miRNA在诊治骨肉瘤中的新用途。发明专利技术通过进行测序分析，获得miRNA表达数据，进而进行生物信息学分析，发现在骨肉瘤组中mir-6779高表达显著，进一步的分子生物学验证结果显示，miR-6779-5p和骨肉瘤密切相关，抑制miR-6779-5p表达能有效降低骨肉瘤细胞的增殖能力，可用于临床诊断、预防及治疗，具有很好的实际应用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学领域，具体的涉及，更具体 的涉及mir-6779和/或其成熟miRNA在诊治骨肉瘤中的新用途。
技术介绍
骨肉瘤(Oseteosarcoma)是除浆细胞瘤外最常见的恶性骨原发性肿瘤，其组织学 特点是在多数情况下肿瘤细胞产生骨样或不成熟骨。该病好发于青少年长骨时期，起病时 无明显的临床症状，极易与外伤混淆，且恶性程度高，故其危害性大死亡率很高。虽然临床 骨科工作者一直致力于对其防治的研究，但近几年骨肉瘤总体5年生存率仍然徘徊不前，因 此，寻找到骨肉瘤早期精确诊断和治疗的有效靶点任重而道远。 MicroRNAsUiRNAs)是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码 RNA。成熟的miRNAs是由较长的初级转录物经过一系列核酸酶的剪切加工而产生的，随后组 装进RNA诱导的沉默复合体，通过碱基互补配对的方式识别祀mRNA，并根据互补程度的不同 指导沉默复合体降解祀mRNA或者阻遏祀mRNA的翻译。 本专利技术通过收集骨肉瘤患者血液样本，通过I Ilumina平台进行测序分析，获得 miRNA表达数据，进而进行生物信息学分析，发现在骨肉瘤组中mir-6779高表达显著，进一 步的分子生物学验证结果显示，miR-6779-5p和骨肉瘤密切相关，抑制mir-6779-5p表达能 有效降低骨肉瘤细胞的增殖能力，可用于临床诊断及预防检测，具有很好的实际应用价值。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种治疗骨肉瘤药物组合物，其特征在于，所述药物组合 物包含： (a)下调mir-6779和/或其成熟miRNA的转录和/或抑制其成熟miRNA的活性的试 剂； (b)药剂学上能接受的载体。 进一步，采用mir-6779和/或其成熟miRNA的反义寡核苷酸、antagomiRs、miRNA海 绵、miRNA Erasers、Target Masking和/或多祀点反义寡核苷酸下调mir-6779和/或其成熟 miRNA转录和/或抑制其成熟miRNA的活性;优选的，采用anti-miR-6779_5p下调mir-6779 和/或其成熟miRNA的转录和/或抑制其成熟miRNA的活性的试剂，所述anti-miR-6779-5p序 列为SEQ ID NO 8。 本专利技术的目的在于，提供上述药物组合物在制备治疗骨肉瘤试剂中的应用。 进一步，所述药物组合物抑制骨肉瘤细胞的增殖。本专利技术的目的还在于提供mir-6779和/或其成熟miRNA在制备预防、诊断和/或治 疗骨肉瘤试剂中的应用。mir-6779的序列见序列表SEQ ID NO Umir-6779的成熟miRNA为 miR-6779-5p和miR-6779-3p其序列见序列表SEQ ID NO 2(miR-6779-5p)和SEQ ID NO 3 (miR-6779-3p)〇进一步，所述的预防、诊断骨肉瘤试剂包括基于高通量测序方法和/或基于定量 PCR方法和/或基于探针杂交方法检测骨肉瘤样本中mir-6779和/或其成熟miRNA的转录或 基于免疫检测方法检测骨肉瘤样本中其成熟miRNA调控的靶基因的表达情况，优选采用 northern杂交方法、miRNA表达谱芯片、核酶保护分析技术、RAKE法、原位杂交、基于微球的 流式细胞术检测骨肉瘤样本中mir-6779和/或其成熟miRNA的转录。优选的，所述的基于定量PCR方法包括特异性扩增mir-6779和/或其成熟miRNA的 引物，进一步优选特异性扩增mir-6779成熟miRNA引物序列为SEQ ID NO 4;特异性扩增 mir-6779引物序列为SEQ ID NO 5和SEQ ID NO 6,所述的基于探针杂交方法包括与mir-6779 和 / 或其成熟 miRNA 的核酸序列杂交的探针。 进一步，所述的治疗骨肉瘤试剂包括下调mir-6779和/或其成熟miRNA的转录和/ 或促进其成熟miRNA的活性的试剂。优选的，采用anti-miR-6779-5p抑制mir-6779成熟 miRNA的活性，所述anti-miR-6779-5p序列为SEQ ID NO 8。 本专利技术的目的在于提供一种骨肉瘤诊断试剂，所述骨肉瘤诊断试剂能够检测骨肉 瘤样本中mir-6779和/或其成熟miRNA的转录或免疫检测方法检测骨肉瘤样本中其成熟 miRNA调控的靶基因的表达情况。 进一步，所述骨肉瘤诊断试剂基于高通量测序方法和/或基于定量PCR方法和/或 基于探针杂交方法检测骨肉瘤样本中mir-6779和/或其成熟miRNA的转录或基于免疫方法 检测骨肉瘤样本中其成熟miRNA调控的革El基因的表达情况，优选采用northern杂交方法、 miRNA表达谱芯片、核酶保护分析技术、RAKE法、原位杂交、基于微球的流式细胞术检测骨肉 瘤样本中mir-6779和/或其成熟miRNA的转录。优选的，所述的用于定量PCR方法包括特异性扩增mir-6779和/或其成熟miRNA的 引物；所述的基于探针杂交方法包括与mir-6779和/或其成熟miRNA的核酸序列杂交的探 针。 定义： 现阶段检测miRNA的表达水平的方法主要包括基于高通量测序技术、基于核苷酸 杂交和基于PCR的miRNA检测方法。基于探针杂交技术的miRNA检测方法是一种直接检测法， 不需要对样本RNA进行预扩增，包括northern杂交方法、miRNA表达谱芯片、核酶保护分析技 术、RAKE法、原位杂交、基于微球的流式细胞术等技术。 (I )Northern 杂交 又称RNA印迹技术为最经典的检测真核生物RNA大小，估计其丰度的实验方法。基 本原理如下：首先在载体(如娃片、微球或膜等)上固定miRNA样本，再与经过标记的探针杂 交，洗涤多余的杂交探针后进行信号检测；也可以在载体上先固定与靶miRNA序列互补的 DNA探针，然后与经过标记的样本miRNA杂交，再进行信号检测。信号标记的方法包括同位素 标记、荧光标记和纳米金标记等。 (2)miRNA表达谱芯片原理同样是使用标记探针检测固相支持物上的目标分子。通过设计芯片上miRNA 基因及内参序列，可精确分析出样品中相应miRNA的表达水平。基因芯片具有高通量的优 点，可以一次在同一样本中检测出几百个基因的全部表达。Luminex公司研制的液相芯片 (Liquid chip)又称多功能悬浮点阵（Multi analyte suspension array，MASA)，是出的新 一代生物芯片技术。液相芯片体系由许多小球体为主要基质构成，每种小球体上固定有不 同的探针分子，为了区分不同的探针，每一种用于标记探针的球形基质都带有一个独特的 色彩编号，将这些小球体悬浮于一个液相体系中，就构成了液相芯片系统。该系统可以对同 一个微量样本中的多个不同分子同时进行快速的定性、定量分析，这种检测技术被称为 FMAP(Flexible multianalyte profiling)技术。分子杂交在悬浮溶液中进行，检测速度极 快。 (3)核酶保护分析技术(RPA) miRNA的检测还可以采用核酶保护分析技术，将标记好的探针和待测RNA样本混 合，热变性后杂交，未杂交的RNA和多余的探针用单链核酸酶消化，热失活核酸酶本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种治疗骨肉瘤药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含：(a)下调mir‑6779和/或其成熟miRNA的转录和/或抑制其成熟miRNA的活性的试剂；(b)药剂学上能接受的载体。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：何春耒，高辉，刘午阳，黄为民，刘胜，吴东保，何澄，徐房添，杨亚东，
申请(专利权)人：赣南医学院第一附属医院，
类型：发明
国别省市：江西;36